[發明專利]一種熱啟動DNA聚合酶及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011277378.8
• 申請日: 2020-11-16
• 公開（公告）號: CN112359031A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 許秀麗;周裕軍;常緣榮
• 申請（專利權）人: 北京丹大生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12Q1/686
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 呂紀濤

本發明提供了一種熱啟動DNA聚合酶及其制備方法和應用，屬于核酸化學技術領域，將雙酸酐對DNA聚合酶進行修飾，得到熱啟動DNA聚合酶。本發明提供的熱啟動DNA聚合酶在溫度低于37℃時的擴增緩沖溶液中時，其酶活活性在1h內無明顯增加；而在高于50℃的擴增緩沖溶液中時，其酶活活性在10min內快速提高到正常水平。

技術領域

本發明屬于核酸化學技術領域，尤其涉及一種熱啟動DNA聚合酶及其制備方法和應用。

背景技術

在PCR擴增的每次循環中，一雙鏈靶序列被變性，引物退火于變性靶序列的每條鏈上，并且引物通過DNA聚合酶的作用而延伸。擴增的特異性決于引物雜交的特異性。選用與存在于靶核酸序列每一鏈的3′末端上的序列互補或基本上互補的引物。在用于典型PCR的高溫度下，引物只與期望的靶序列雜交。然而，典型地是在室溫下裝配擴增反應混合物，大大低于需要確保引物雜交特異性的溫度。在這種較不嚴緊的條件下，引物可能非特異性地結合于其它只部分互補的核酸序列(或者甚至結合于其它引物)并起始非所需延伸產物的合成，該產物可以與靶序列一起擴增。非特異性引物延伸產物的擴增可以與所需靶序列的擴增競爭，并且可以明顯降低所需序列的擴增效力。由非特異性擴增引起的問題在Chou etal.，1992，Nuclei Acids Research 20(7)：1717-1723中作了進一步地討論。

非特異性擴增可以通過減少由反應開始前結合于非靶序列的引物形成的延伸產物而減少。在一種稱作“熱起始”方案的方法中，從反應混合物中減除一或多種關鍵性試劑，直至溫度升至足以提供需要的雜交特異性。在這種方式中，在反應條件不能確保特異性引物雜交的時期，反應混合物不能支持引物延伸。

熱起始法可以通過在起始高溫溫育步驟之后，打開反應試管，加入缺失試劑而手工進行。然而，手工熱起始法是費工的且增加污染反應混合物的危險。采用熱易變性材料如蠟來分離或隔絕反應組分的熱起始法描述于美國專利U.S.5,411,876和Chou等1992同上的文獻中。在這些方法中，高溫預反應溫育熔融熱易變性材料，由此讓試劑混合。

其它的減少由反應開始前結合于非靶序列的引物形成延伸產物的方法依賴于采用一種熱可逆性方式非共價結合于DNA聚合酶的化合物來抑制DNA聚合酶。美國專利U.S.5,338,671描述了應用對熱穩定DNA聚合酶有特異性的抗體來抑制DNA聚合酶活性。這些抗體必須在裝配反應混合物前在室溫下緩沖液中與DNA聚合酶一起溫育，以使形成抗體-DNA聚合物復合物。抗體抑制DNA聚合酶的活性由高溫預反應溫育使其失活。此方法的缺點是生產對DNA聚合酶有特異性的抗體是昂貴和費時的，特別是大量生產時。再則，向反應混合物加入抗體可能需要重新設計擴增反應。

擴增產物的形成也可以由添加以熱可逆方式非共價結合于引物的化合物來抑制，由此防止引物雜交于任何序列。靶序列或其它。例如，加入反應混合物的單鏈結合蛋白會結合引物，由此防止引物雜交和抑制引物延伸。采用基因32蛋白改善PCR產物產率的方法描述于Schwarz et al.，1990，Nucleic Acids Research 18(4)：10中。

非特異擴增可以通過降解由反應開始前結合于非靶序列的引物形成的延伸產物而減少。如采用描述于U.S.5,418,149和WO 92/01814中的方法。降解新合成的延伸產物可以通過摻入反應混合物dUTP和UNG，并在進行擴增反應前在45-60℃下溫育反應混合物而取得。此方法的缺點是延伸產物的降解和延伸產物的形成競爭，非特異性引物延伸產物的消除很可能是較不完全的。

非特異性擴增也可以通過利用某些化學物進行修飾來抑制反應前的DNA聚合酶的活性。如采用描述于CN1282741C的方法，通過利用類似二羧酸酐對DNA聚合酶的賴氨酸殘基進行修飾，使DNA聚合酶在低溫下酶活性受到抑制，而在高溫條件下兩者分離快速釋放酶活。此方法的缺點是二羧酸酐的化學修飾效果較弱，堿性溶液中的溶解度不高，修飾DNA聚合酶所需摩爾比較高，容易導致沉淀。再則，所修飾的DNA聚合酶在高溫解離后酶活釋放不完全，導致DNA聚合酶活性降低。

發明內容