[發明專利]一種金果欖組織培養方法

在審

• 申請號: 202011276423.8
• 申請日: 2020-11-16
• 公開（公告）號: CN112273236A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 楊玉霞;陳華;周先建;胡平;陳鐵柱;方清茂;余馬
• 申請（專利權）人: 四川省中醫藥科學院;西南科技大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 趙浩竹

本發明提出了一種金果欖組織培養方法，首先獲得無菌外植體，然后啟動培養基的篩選，再篩選增殖培養基，最后再進行生根和移栽；組培苗在1/2MS培養基上生長2周后開始出現根系，4周統計生根率為100％，平均根數為6條，平均根長為6.2cm。移栽到基質中成活率為90％，生長良好，4周后能觀察到新葉的生成，6周后根系生長旺盛，上部莖開始從基部分化。

技術領域

本發明涉及金果欖培養領域，具體涉及一種金果欖組織培養方法。

背景技術

金果欖為防己科青牛膽屬青牛膽Tinospora sagittata(Oliv.)Gagnep.或金果欖Tinospora capillipes Gagnep.的干燥塊根，為常綠纏繞藤本植物，主產于四川、湖南、廣西、湖北、貴州等地，具有清熱解毒、利咽止痛的功效，主治咽喉腫痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾、脘腹熱痛等。金果欖塊根含掌葉防己堿、咖倫賓、巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿、千金藤堿、蝙蝠葛堿和木蘭花堿等成分，民間廣泛用于治療胃痛。現代藥理學研究表明，金果欖有明顯的抗炎鎮痛、抗菌、抗腫瘤、降血糖、抗應激及解毒等作用，又被喻為可替代抗生素的天然藥物。由于長期采挖，金果欖野生資源日趨枯竭，人工種植和撫育勢在必行。另外，金果欖雌雄異株，授粉受到環境影響極大，自然結實率低。在資源調查和引種中發現，雄株遠多于雌株，結果機會大大減少，且種子有明顯的休眠期，發芽率較低。這也導致現有的金果欖的人工培養繁殖效率較低，成本較大，因此，解決這一類的問題顯得尤為重要。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提出一種金果欖組織培養方法，首先獲得無菌外植體，然后啟動培養基的篩選，再篩選增殖培養基，最后再進行生根和移栽。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種金果欖組織培養方法，包括以下步驟：

步驟一：獲取無菌外植體

首先選取健壯、腋芽飽滿的金果欖枝條，剪去莖段上的葉片，形成1-2cm長短的莖段，每個莖段帶一個腋芽，然后放入燒杯中，并滴入2-3滴洗潔精，加入自來水進行震蕩，燒杯頂部用紗布包裹，并置于自來水下沖洗30min；然后在超凈工作臺上先用75％酒精浸潤莖段30s，接著用無菌水沖洗2-3次，然后倒入0.1％HgCl₂，滴入1-2滴吐溫-20，震蕩消毒4-7min，無菌水沖洗4-5遍；然后將滅菌后的莖段接種到無激素的MS培養基。

步驟二：啟動培養基的篩選

7天后將無污染的莖段接種到9種MS+不同濃度組合BAP和NAA組成的啟動培養基中，然后4周后統計出芽率。

步驟三：增殖培養基的篩選

將誘導出的腋芽從莖段上切下，接種到9種MS+不同濃度組合TDZ、BAP和NAA組成的增殖培養基，6周后統計增殖系數和平均苗高。

步驟四：生根和移栽

將增殖的叢生芽分成單棵，接種到無激素的1/2MS培養基中進行生根，4周后統計生根數和平均根長；將生根后的金果欖采取逐步開瓶的方式，第一天擰松蓋子、第二天蓋子開一半，持續二天，第三天蓋子開2/3，持續二天，第六天蓋子全部打開，持續一天，第七天把組培苗從瓶子中取出，洗凈根部的培養基，移栽到基質上，2周后統計成活率。

步驟五：給出統計方法

污染率＝(污染的苗數/總苗數)×100％；

褐化率＝(褐化的苗數/總苗數)×100％；

出芽率＝(萌發的苗數/總苗數)×100％；

增殖系數＝增殖株數/接種株數

數據經SPSS通過單因素方差分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

步驟六：得出最優的培養方法