[發明專利]一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法

在審

• 申請號: 202011275099.8
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN112553350A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 吳濤;陳豪
• 申請（專利權）人: 吳濤
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32;C12R1/325;C12R1/33
• 代理公司: 北京勁創知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 徐莉娟

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法。包括如下步驟：(1)獲得患者體液樣本，并對體液樣本進行處理；(2)提取體液樣本核酸；(3)制備試劑；(4)在反應管內加入反應混合液和體液樣本核酸，離心；(5)將反應管放置在溫度為65℃的環境中，使體液樣本核酸發生擴增反應；(6)檢測步驟(5)中得到的擴增產物，得到檢測結果。本發明利用環介導等溫擴增技術自建的體系可快速檢測結核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和偶發分枝桿菌等6種分枝桿菌，可快速實現結核病和常見非結核分枝桿菌肺病的快速檢測。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法。

背景技術

分枝桿菌屬(Mycobacterium)細菌感染人類引發的重大疾病主要包括結核病(tuberculosis,TB)和近年來因發病率不斷攀升而備受關注的非結核分枝桿菌病(nontuberculous mycobacterial diseases)。TB是以結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)為代表的結核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex,MTC)侵犯全身多個器官和組織引起的慢性傳染性疾病，其中以侵犯肺部的肺結核(pulmonary tuberculosis,PTB)最為多見，占結核病總病例數的90％以上。TB為全球十大死亡原因之一，已超越艾滋病成為單種病原體引起死亡最多的感染性疾病。WHO《2019年全球結核病報告》顯示，全球目前約有四分之一的人口感染MTB，其中5-10％將最終罹患結核病。中國的結核病發病率高居全球第二，是新增結核病例最多、多藥耐藥結核病發生率最高的國家之一，有效地遏制結核病的流行刻不容緩。

非結核分枝桿菌病是除MTC和麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)以外的分枝桿菌-非結核分枝桿菌(Nontuberculous mycobacteria,NTM)引發的疾病。NTM普遍存在于土壤和水等自然環境中，能夠引起肺部、淋巴結、關節、中樞神經系統以及與導管相關的播散性感染。非結核分枝桿菌肺病(Nontuberculous mycobacterial pulmonary disease,NTM-PD)占非結核分枝桿菌病的絕大多數，發病率約為2/10萬至78/10萬，在全球范圍內呈逐年快速增多的趨勢。在一些發達國家，NTM-PD的發病率甚至已超過PTB，成為又一個由分枝桿菌引起的嚴重威脅人類健康的重要公共衛生問題。更為棘手的是NTM-PD的臨床癥狀和體征(咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、氣急、盜汗、低熱、乏力、消瘦和萎靡不振等)以及影像學特征與PTB十分相似，很多病例在不能及時獲得有效的病原微生物學證據的情況下，極易被誤診為PTB，甚至多藥耐藥PTB。然而，NTM對抗結核藥物的天然耐藥率非常高，多數NTM對一線抗結核藥物的耐藥率在60％以上，個別甚至達到80％以上。一旦NTM-PD患者被誤診為PTB，按照抗結核方案治療必將導致臨床癥狀遷延不愈，終末期患者常因肺組織的持續破壞出現大咯血或呼吸衰竭而死亡。因此，臨床診療中對NTM-PD和PTB疑似病例精準快速的鑒別十分重要。國內外多個指南和共識明確指出，快速可靠的病原微生物學證據，特別是對分枝桿菌精確到“種水平”的鑒定是鑒別NTM-PD和PTB的關鍵所在。

目前臨床上廣泛采用的分枝桿菌分子診斷方法多基于PCR技術和核酸雜交技術構建，因此，需要配備精密熱循環裝置的昂貴的PCR分析儀和核酸雜交儀，同時需根據相關法規配置完備的實驗室條件以及經過嚴格培訓的專業技術人員。且大多數此類項目臨床應用中仍存在假陽性率高、檢測周期過長及操作繁雜等諸多弊端。最重要的是，基于PCR技術和雜交技術的現行方法不能快速檢測結核病和常見分枝桿菌肺病。

發明內容

本發明提供了一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法。本發明利用環介導等溫擴增技術自建的體系可快速檢測結核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和偶發分枝桿菌等6種分枝桿菌，可快速實現結核病和常見非結核分枝桿菌肺病的快速檢測。

本發明通過下述技術方案實現：