[發明專利]一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法

在審

• 申請號: 202011275099.8
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN112553350A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 吳濤;陳豪
• 申請（專利權）人: 吳濤
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32;C12R1/325;C12R1/33
• 代理公司: 北京勁創知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 徐莉娟

1.一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)獲得患者體液樣本，并對體液樣本進行處理；

(2)提取體液樣本核酸；

(3)制備試劑：

Ⅰ、將結核分支桿菌復合群引物、緩沖液和dNTPs混合；

將胞內分枝桿菌引物、引物標記、緩沖液和dNTPs混合；

將鳥分枝桿菌引物、緩沖液和dNTPs混合；

將膿腫分枝桿菌引物、緩沖液和dNTPs混合；

將堪薩斯分枝桿菌引物、緩沖液和dNTPs混合；

將偶發分枝桿菌引物、緩沖液和dNTPs混合；

Ⅱ、對步驟Ⅰ得到的混合液分別加入Bst DNA聚合酶，振蕩、離心得到混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六；

(4)在多個反應管內分別內加入混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六，再在多個反應管內加入體液樣本核酸，離心；

(5)將多個反應管放置在溫度為65℃的環境中，使體液樣本核酸發生擴增反應；

(6)檢測步驟(5)中得到的擴增產物，得到檢測結果。

2.如權利要求1所述的一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法，其特征在于：步驟(6)中的檢測方法包括色度法，包括如下步驟，

A：將陽性對照引物、緩沖液和dNTPs混合；

將陰性對照引物、緩沖液和dNTPs混合；

B：對步驟A得到的混合液分別加入熒光劑和Bst DNA聚合酶，振蕩、離心得到混合液七和混合液八；

C：在2個反應管內分別加入混合液七和混合液八，再向陽性混合液七的反應管內加入體液樣本核酸，向陰性混合液八對應的反應管中加入無核酶PCR級純水，離心；

D：將陽性混合液七和陰性混合液八的反應管放置在溫度為65℃的環境中，使體液樣本核酸發生擴增反應；

E：將含有混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六的反應管與含有混合液七和混合液八的反應管在光照下對比；

則步驟(3)中試劑制備時也需要加入熒光劑。

3.如權利要求2所述的一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法，其特征在于：步驟(3)中加入熒光劑的制備方法為：

Ⅰ、將結核分支桿菌復合群引物、緩沖液和dNTPs混合；

將胞內分枝桿菌引物、緩沖液和dNTPs混合；

將鳥分枝桿菌引物、緩沖液和dNTPs混合；

將膿腫分枝桿菌引物、緩沖液和dNTPs混合；

將堪薩斯分枝桿菌引物、緩沖液和dNTPs混合；

將偶發分枝桿菌引物、緩沖液和dNTPs混合；

Ⅱ、對步驟Ⅰ得到的混合液分別加入熒光劑和Bst DNA聚合酶，振蕩、離心得到混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六。

4.如權利要求2或3所述的一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法，其特征在于：所述熒光劑包括Calcein/鈣黃綠素、SYBR Green、Eva Green、HNB。

5.如權利要求1所述的一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法，其特征在于：步驟(6)中的檢測方法包括試紙檢測方法，

體液樣本核酸擴增結束后，室溫放置，離心，加入TE(Tris-EDTA)緩沖液，混勻，用一次性核酸試紙檢測。

6.如權利要求1所述的一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法，其特征在于：步驟1中所述患者體液樣本包括痰樣本和其他體液樣本；

所述痰樣本的處理方法為：使用N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉法(NALC-NaOH)進行消化滅活15min；

所述其他體液樣本的處理方法為：離心富集細菌。

7.如權利要求1所述的一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法，其特征在于：步驟(3)中所述的緩沖液包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄、KCl、Tris、甜菜堿、Tween、(NH₄)₂SO₄。

8.如權利要求1所述的一種能快速檢測多種分枝桿菌的方法，其特征在于：所述結核分支桿菌復合群引物、胞內分枝桿菌引物、鳥分枝桿菌引物、膿腫分枝桿菌引物、堪薩斯分枝桿菌引物和偶發分枝桿菌引物的標記包括FITC(異硫氰酸熒光素)、FAM(6-羧基熒光素)、Biotin(生物素)。