[發明專利]逆轉錄酶突變體及逆轉錄方法

有效

• 申請號: 202011271786.2
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN114480337B
• 公開（公告）日: 2023-07-28
• 發明（設計）人: 蔣析文;劉靄珊;鄭桑桑;趙繼光
• 申請（專利權）人: 廣州達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12P19/34
• 代理公司: 上海助之鑫知識產權代理有限公司 31328
• 代理人: 陳詳

本發明提供了逆轉錄酶突變體及逆轉錄方法，具體地，本發明構建了逆轉錄酶(M?MLV)突變庫，通過逐步篩選，最終篩選出了熱穩定性提高且擴增效率較高的突變體，進而提供了使用該逆轉錄酶突變體的高效逆轉錄方法。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種逆轉錄酶突變體及逆轉錄方法。

背景技術

鼠白血病逆轉錄酶(M-MLV)是一種以RNA為模板的DNA聚合酶，具有RNase?H活性，不具有3’-5’外切酶活性，可用于逆轉錄合成cDNA。由于RNA具有較復雜的二級結構，對M-MLV酶的逆轉錄效率影響較大。打開RNA二級結構最簡單的方法是通過高溫使二級結構的氫鍵打開，RNA變為線性單鏈。但野生型的M-MLV酶最適反應溫度為37℃，高溫下穩定性下降并且活性降低。因此通過突變使M-MLV酶的熱穩定性提高，使其適應高溫下的反應是M-MLV酶的主要改造方向。

M-MLV酶的突變改造有以下的途徑：

1、隨機突變。對M-MLV全長序列或者某一結構域進行隨機突變，然后進行篩選。此方法可篩選出高活性和高熱穩定性的MMLV突變體，但技術過程繁復，隨機突變產生的突變庫容量可達到10⁷，伴隨大量的無活性突變，篩選難度極大。(參考文獻：Arezi?B,HogrefeH.Novel?mutations?in?Moloney?Murine?Leukemia?Virus?reverse?transcriptaseincrease?thermostability?through?tighter?binding?to?template-primer[J].Nucleic?Acids?Research,2008,37(2):473-481.)

2、對特定活性位點進行定點突變。此方法針對性較強，通過增加核酸結合位點、金屬離子結合位點等關鍵活性位點氨基酸與底物的親和力，提高酶活。但此方法缺乏對酶整體結構的分析，不能從整體上提高酶的穩定性。(參考文獻：Yasukawa?K,Mizuno?M,KonishiA,et?al.Increase?in?thermal?stability?of?Moloney?murine?leukaemia?virusreverse?transcriptase?by?site-directed?mutagenesis[J].Journal?ofBiotechnology,2010,150(3):299-306.)

總體而言，由于蛋白質結構的復雜性，不僅是位于活性位點的氨基酸甚至一些遠離活性位點的氨基酸都可能對酶的整體結構及性能產生影響，因此酶的改造存在極大的不確定性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種耐高溫且具有高逆轉錄效率的逆轉錄酶突變體。

在本發明的第一方面，提供了一種M-MLV酶突變體，所述M-MLV酶突變體在選自下組的至少兩個(可以為兩個、三個、四個、或五個)位點發生突變：第446位氨基酸殘基、第313位氨基酸殘基、第583位氨基酸殘基、第607位氨基酸殘基、第221位氨基酸殘基，其中氨基酸殘基編號采用SEQ?ID?NO.1所示的編號。

對應的野生型鼠白血病逆轉錄酶(M-MLV)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

在另一優選例中，所述M-MLV酶突變體中，第446位的氨基酸殘基位點突變為Cys。

在另一優選例中，所述M-MLV酶突變體中，第313位的氨基酸殘基位點突變為His或Gln。

在另一優選例中，所述M-MLV酶突變體中，第583位的氨基酸殘基位點突變為Asn。

在另一優選例中，所述M-MLV酶突變體中，第607位的氨基酸殘基位點突變為Lys。

在另一優選例中，所述M-MLV酶突變體中，第221位的氨基酸殘基位點突變為Arg。