[發明專利]一種高效發酵生產L-丙氨酸的菌株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202011270813.4
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN114480234A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 張莎莎;史魯秋;蘇桂珍;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 南京華獅新材料有限公司;南京盛德生物科技研究院有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/31;C12N15/70;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇舜點律師事務所 32319
• 代理人: 洪黎

本發明公開了一種高效發酵生產L?丙氨酸菌株，其特征在于，該菌株為突變型大腸桿菌重組工程菌株05?DE，于2020年10月23日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC No.20946。本發明構建的菌株能夠高效發酵生產L?丙氨酸。本發明通過對菌株和制造工藝的不斷優化升級，使得產品的品質更好、成本更低，具有很大的市場前景。

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，具體涉及一種高效發酵生產L-丙氨酸的菌株及其構建方法和應用。

背景技術

L-丙氨酸是一種非必需氨基酸，也是人體血液中含量最高的氨基酸，是血中氮的優良運輸工具，也是一種有效的生糖氨基酸，具有重要的生理功能。在工業、日化、食品、醫藥等領域L-丙氨酸也有廣泛的用途。

在日化領域，L-丙氨酸是生產無磷洗滌劑甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)的主要原料，隨著歐美國家對含磷洗滌劑使用的限制，無磷洗滌劑近年發展迅猛，對MGDA原料L- 丙氨酸的需求也日益提升；以L-丙氨酸和椰子油為原料合成的N-月桂酰-L-丙氨酸是最常用的幾種氨基酸表面活性劑之一，現已用于牙膏、洗發液、洗面奶等多個洗滌護膚類產品；在食品領域，L-丙氨酸可以作為天然甜味劑改善食品的風味，同時可提高食品及飲料中的蛋白質利用率，食用后能迅速消除疲勞，恢復體力；在醫藥領域，L-丙氨酸是合成維生素B6和氨基丙醇的主要原料，是營養劑補糖氨基酸營養輸液的主要成分，也是一種很好的利尿藥。日化、食品、醫藥等行業的廣泛應用，給原料L-丙氨酸的市場需求帶來了無限增長的商機。

目前市場上銷售的L-丙氨酸生產和銷售廠家眾多。已有的L-丙氨酸生產工藝也有多種，包括化學法，酶轉化法和生物發酵法。1)化學法：主要有丙酸氯化氨化法、-溴丙酸氯化法和氰醇法。這些方法都需要石油基原材料，如丙酸、-溴丙酸、乙醛、氫氰酸等，因此成本受到原油價格的影響。此外，這些方法都是經過復雜的化學催化完成的，污染重，分離提取成本高，不適合可持續發展的需求。2)酶轉化法：以L-天冬氨酸為原料，在L-天冬氨酸-脫羧酶的催化下進行脫羧反應生成L-丙氨酸。該方法是目前國內 L-丙氨酸生產廠家主要使用的生產技術。但是由于該方法中的原材料天冬氨酸的生成是以順酐為原料的，因此該生產路線的成本依舊依賴于石油價格。3)生物發酵法：近年來已經有多個報道利用基因工程手段在E.coli中實現了L-丙氨酸的合成。所得工程菌能夠以葡萄糖為原料，通過厭氧微生物發酵法合成L-丙氨酸。目前國內采用該方法的廠家主要是安徽華恒生物科技股份有限公司，相關的專利主要有CN 103602623 B，CN 103898089 B，CN 109055451 A，CN 108642041A，CN 102603548 B，CN 106748847 B，CN 108484423 A等。其構建的基因工程菌是通過將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L- 丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在發酵罐中連續傳代培養而得到的基因工程菌，發酵48h 產量可達115g/L，轉化率為0.96g/g，生產強度約2.4g/L/h。由于其采用了厭氧發酵工藝，所得細胞密度低，只有大約5g/L，生產強度也較低。且種子培養基中添加了酵母浸粉，原料成本高。

基于以上，提供一種能夠高效發酵生產L-丙氨酸的菌株及其構建方法對提高L-丙氨酸的產量并且降低生產成本具有重要意義。

發明內容

本發明的主要目的在于：針對上述問題，提供一種高效發酵生產L-丙氨酸的菌株及其構建方法和應用。本發明通過基因工程構建高產L-丙氨酸的菌株，能夠明顯提高菌種密度和生產強度，同時采用無機鹽培養基進行發酵培養，進一步降低了生產成本，生產過程更加綠色環保，市場競爭優勢明顯。

本發明的目的及解決其技術問題是采用以下技術方案來實現的。