[發(fā)明專利]一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

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• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN114480234A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張莎莎;史魯秋;蘇桂珍;其他發(fā)明人請求不公開姓名
• 申請（專利權(quán)）人: 南京華獅新材料有限公司;南京盛德生物科技研究院有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/31;C12N15/70;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇舜點律師事務(wù)所 32319
• 代理人: 洪黎

1.一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸菌株，其特征在于，該菌株為突變型大腸桿菌重組工程菌株05-DE，于2020年10月23日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC No.20946。

2.一種如權(quán)利要求1所述的高效發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

宿主菌株的構(gòu)建：用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(gapA)替換野生型大腸桿菌基因組中的乳酸脫氫酶基因(ldhA)，用葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因(pgi)替換野生型大腸桿菌基因組中的丙酮酸氧化酶基因(poxB)，用6-磷酸果糖激酶II基因(pfkB)替換野生型大腸桿菌基因組中的丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)，用二磷酸果糖醛縮酶I基因(fbaB)替換野生型大腸桿菌基因組中的丙氨酸消旋酶基因(dadX)，用丙酮酸激酶I基因(pykF)替換野生型大腸桿菌基因組中的脂類A生物合成豆蔻酰基轉(zhuǎn)移酶基因(lpxM)，得到突變型大腸桿菌，命名為HAa05；

質(zhì)粒的構(gòu)建：將L-丙氨酸脫氫酶基因(alaD)和L-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因(alaE)以串聯(lián)的方式插入質(zhì)粒載體pSB1s的NcoI和EcoRI位點間得到重組載體質(zhì)粒，命名為pDE；

工程菌株的構(gòu)建：將上述重組載體質(zhì)粒pDE導(dǎo)入上述突變型大腸桿菌HAa05中，即得到重組工程菌株，命名為05-DE；

其中，所述野生型大腸桿菌為大腸桿菌K12 MG1655；

所述突變型大腸桿菌基因型為E.coli BW25113ΔldhA::gapA,ΔpoxB::pgi,ΔpflB::pfkB,ΔdadX::fbaB,ΔlpxM::pykF；

所述L-丙氨酸脫氫酶基因(alaD)源自嗜熱脂肪地芽孢桿菌；

所述L-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因(alaE)源自大腸桿菌K-12 MG1655。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組載體質(zhì)粒pDE的構(gòu)建步驟如下：

以嗜熱脂肪地芽孢桿菌的基因組DNA為模板，用引物alaD-F和alaD-R進行PCR擴增得到L-丙氨酸脫氫酶基因alaD；所述正向引物alaD-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述反向引物alaD-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

以大腸桿菌K12的基因組DNA為模板，用引物alaE-F和alaE-R進行PCR擴增得到L-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因alaE；所述正向引物alaE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述反向引物alaE-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

將pSB1s載體用NcoI和EcoRI雙酶切后，回收載體大片段，將上述得到的alaD基因片段，alaE基因片段與載體大片段用Gibson方法進行連接，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，涂布含鏈霉素的LB固體平板，37℃過夜，挑取單克隆提取質(zhì)粒，設(shè)計一對引物pBAD-F和pBAD-R進行PCR驗證，篩選出正確構(gòu)建的重組載體質(zhì)粒pDE；所述正向引物pBAD-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，所述反向引物pBAD-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組載體質(zhì)粒pDE是將pSB1s載體的NcoI和EcoRI位點間的片段替換為L-丙氨酸脫氫酶基因和L-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因得到的；所述pSB1s載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述L-丙氨酸脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述L-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。