[發明專利]一種用于檢測轉基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探針組合及現場快速檢測方法

在審

• 申請號: 202011270769.7
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN112359127A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 汪小福;陳欲;徐俊鋒;陳笑蕓;彭城;徐曉麗;魏巍;楊蕾
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 王煥

本發明提供了一種用于檢測轉基因大豆SHZD32?1的RPA引物和探針組合及現場快速檢測方法。通過對轉基因大豆SHZD32?1的轉化體特異性序列設計RPA引物和探針，結合DNA快速提取方法以及通過熒光燈的照射直接判別檢測結果，可在30分種內完成對轉基因大豆SHZD32?1的現場快速可視化檢測。本發明無需特殊儀器，可以實現在非實驗條件下(例如大豆種植基地)對核酸的快速、特異性檢測。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，尤其是涉及一種用于檢測轉基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探針組合及現場快速檢測方法。

背景技術

目前，轉基因大豆是全球種植面積最大的轉基因作物。我國是世界上消費轉基因大豆量最大的國家。我國的轉基因大豆主要依靠進口。因此，研發擁有我國自主產權的轉基因大豆具有重要的意義。SHZD32-1耐草甘膦大豆(即耐除草劑大豆SHZD32-1)是由我國上海交通大學自主研發的轉基因大豆，是利用農桿菌介導法將優化的耐草甘膦基因G10-EPSPS導入了栽培大豆品種豆32中獲得轉G10-EPSPS基因的耐草甘膦大豆。現階段，SHZD32-1耐草甘膦大豆已拿到安全證書。未來，SHZD32-1可能是我國第一個進行商業化種植的轉基因大豆，由于轉基因管理和監控的需要，迫切需要建立針對轉基因大豆SHZD32-1的方便、快捷的現場快速檢測方法。

目前，聚合酶鏈式反應(PCR)是轉基因檢測的金標準方法，其檢測靈敏度高，結果穩定可靠，成為目前最常用的轉基因檢測方法。然而，PCR檢測方法，需要大型儀器，對場地及操作人員要求較高，無法滿足轉基因成分的現場檢測的需要。另一種轉基因成分快速檢測方法是蛋白質試紙條方法，該方法是將特異的抗體交聯到試紙條上，根據抗原與抗體特異性結合從而達到對轉基因作物的檢測。該方法操作簡單，且耗時短。但蛋白質試紙條需要依賴特異性的抗體，而特異性抗體的獲得和制備比較繁雜。另外，蛋白質試紙條只能針對轉基因作物表達的外源蛋白質進行檢測，而無法對轉基因作物中常用元件如啟動子和終止子進行檢測，同時也無法對轉基因作物的特定轉化體進行檢測鑒定。

恒溫擴增技術是近些年興起的核酸檢測技術，如環介導等溫擴增技術、鏈替換擴增技術、依賴解旋酶的等溫擴增技術、核酸序列依賴擴增和重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase polymerase amplification，RPA)等。其中RPA技術的擴增溫度為37℃左右，其擴增效率高，一般20分鐘能完成擴增，而且其對檢測樣品的純度要求不高，具有一定抗抑制因子的能力。RPA技術的這些特性，展現了其在轉基因成分現場快速檢測方面的廣闊前景。

然而，目前主要有兩個問題制約恒溫擴增技術在現場檢測方面的應用，一是核酸的快速提取，二是快速擴增與結果判別。一方面，傳統的核酸提取方法操作繁雜，耗時費力，即使是常用的核酸提取試劑盒，其提取的時間也在1個小時左右，而且還需要離心機等設備，不能滿足現場快速檢測的需要。另一方面，恒溫擴增技術雖然保證了核酸的快速擴增，但其與后期結果判別不能很好連接，目前常在擴增后添加熒光染料，這一方面增加操作步驟，也增加了氣溶膠污染的風險；還有就是利用熒光儀器對擴增信號進行檢測。這些方法都不能完好的切合現場快速檢測的需要。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測轉基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探針組合及現場快速檢測方法。通過對轉基因大豆SHZD32-1的轉化體特異性序列設計RPA引物和探針，結合DNA快速提取方法以及通過熒光燈的照射直接判別檢測結果，可在30分種內完成對轉基因大豆SHZD32-1的現場快速可視化檢測。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案如下：

一種用于檢測轉基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探針組合，所述引物包括正向引物和反向引物；

所述正向引物和所述反向引物分別選自以下的任一組：