[發明專利]一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法

在審

• 申請號: 202011270754.0
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN114481334A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 華子昂;劉寶全;朱美瑛;王明齊;竹添;孫寧;萬君興;張建;李娜
• 申請（專利權）人: 北京華牛世紀生物技術研究院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種利用DNA聚合酶在基片上原位合成基因芯片探針的方法，具體為：預先制備共價交聯起始堿基的基片上組裝DNA聚合酶反應體系，利用與探針位置對應的模板指導特定的探針合成，不需要原位化學法合成探針中每步都要脫保護基的繁雜操作而是由DNA聚合酶自動起始和高保真原位合成探針，利用DNA聚合酶可以持續按模板酶法合成長探針的特點克服基因芯片中原位合成探針的長度限制。與現有技術相比，本發明的方法能夠實現像印刷術一樣大量、快速地制備基因芯片，基因芯片制造過程環節中除了能源消耗外僅僅是四種脫氧核糖核苷酸（dNTP）的消耗，極大降低基因芯片的制造成本。

技術領域

本發明涉及生物芯片領域，特別涉及一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法。

背景技術

生物芯片技術已經廣泛應用于臨床疾病診斷、健康管理、藥物研究開發、動植物檢疫、食品檢測、環境監測、科學研究、法醫學檢測等眾多領域，有廣闊的應用前景，市場需求量非常大。

基因芯片是生物芯片中的一類，是通過在芯片的基片上定植一系列的序列已知探針而制備，可用于特定標記核酸的雜交檢測，能通過識別檢測與信息處理來報告檢測對象中核酸信息。

基因芯片制造的關鍵技術就包括如何有效地將探針定植在基因芯片的特定位點上。當前基因芯片上探針的制作方法主要分為兩類：一類是原位化學合成法，在基片的特定位置上按設計程序以化學合成法將核苷酸一個一個地連接在一起形成設計的探針；另一類合成后交聯法，先合成探針，再將合成好的探針定植在基片的特定位置上。

原位化學合成法是在基片上直接合成探針，通過在基片特定位點活化后逐一添加核苷酸完成制備，能夠制造高密度基因芯片；原位化學合成法中，探針共價交聯在基片上非常穩定，優勢顯著；其不足之處在于，造價昂貴，每一步都要在特定位置去保護基團，且基因芯片上探針在長度上每增加一個核苷酸，設備都要進行四輪操作，每一輪完成四種核苷酸中的一種核苷酸的定位合成，占用機器工作時間長；同時，核酸化學合成法沒有校正機制，合成過程不能像生物體系那樣保證100%的準確性。在化學合成法中，如果每一步產率以95%計算，兩步合成產率就是90.3%，三步合成產率只有85.7%。原位合成法制造高密度基因芯片，由于合成產率低、合成步驟多、（帶保護基團的核苷酸）原料造價高且保護基因脫除效率偏低，造成高密度基因芯片造價昂貴，無法大規模應用。

合成后交聯法是先完成探針制備，再打印到基片上，芯片制造成本大幅度降低，但芯片的探針密度受到限制，制造高密度基因芯片難度較大。

發明內容

本發明為解決現有技術中存在不足，利用生物體系中核酸合成的酶法合成技術，通過DNA聚合酶原位完成探針鏈的合成，利用DNA聚合酶的校正活性保證探針序列的準確性而消除探針中出現堿基錯誤的風險，利用DNA聚合酶的持續合成能力一次性完成探針鏈的合成而避免化學原位合成中復雜的多輪操作完成探針延伸，利用DNA聚合酶直接以天然核苷酸進行探針合成有效降低原料成本且避免了核苷酸原料脫除保護基不徹底的弊端，并且可以利用原位合成技術制造高密度基因芯片。

本發明的發明構思是：在基片上高密度原位種植起始堿基，然后在基片上覆蓋DNA聚合酶催化探針合成所需的反應溶液，只要在起始堿基的位置加入探針合成的模板，DNA聚合酶就自動且忠實地完成探針合成。

為解決上述問題，本發明的技術方案如下：一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，包括以下步驟：

S1 在基片上定點種植起始堿基，起始堿基帶有連接臂能夠共價交聯在基片上，堿基可以與后加入的模板的3?端第一個堿基配對；

S2 在種植的起始堿基上加入DNA聚合酶反應體系（無模板），該DNA聚合酶反應體系具備除了模板以外DNA合成的全部物質條件，加入模板即可利用DNA聚合酶原位催化探針合成；

S3用于DNA合成的模板，是一段5?端共價連接在微針上的單鏈DNA，其3?端游離，利用單鏈DNA結合蛋白保持模板DNA處于伸展狀態；