[發明專利]一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法

在審

• 申請號: 202011270754.0
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN114481334A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 華子昂;劉寶全;朱美瑛;王明齊;竹添;孫寧;萬君興;張建;李娜
• 申請（專利權）人: 北京華牛世紀生物技術研究院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1預先制備共價交聯起始堿基的基片（起始堿基通過連接臂共價交聯在基片上）；

S2將DNA聚合酶反應體系覆蓋在起始堿基上，DNA聚合酶反應體系保障DNA聚合酶正常工作；

S3將指導基因芯片的探針合成的模板加入到起始堿基上，起始堿基與模板3'端第一個堿基互補配對并與DNA聚合酶及相關蛋白一起組裝為DNA復制復合體，DNA聚合酶能夠自動且忠實地按模板序列以堿基互補配對原則、以四種堿基（dNTP）為底物完成探針的合成；

S4利用升溫變性的方法將基因芯片上的探針與模板解除配對，將模板從基因芯片上移出，用于新一輪的基因芯片制造。

2.根據權利要求1所述的一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，其特征在于，所用的DNA聚合酶是噬菌體Φ29的DNA聚合酶，也可以是其他能夠以末端蛋白的特定氨基酸羥基進行DNA復制起始的DNA聚合酶。

3.根據權利要求1所述的一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，其特征在于，利用單鏈結合蛋白避免模板DNA形成高級結構并促進起始堿基與模板3'端第一個堿基互補配對，同時與DNA聚合酶及相關蛋白一起組裝為DNA復制復合體，優選噬菌體Φ29的p6單鏈DNA結合蛋白，也可以使用其他單鏈DNA結合蛋白。

4.根據權利要求1所述的一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，其特征在于，使用噬菌體Φ29的末端蛋白增強探針合成的DNA復制起始體系的組裝，也可以用腺病毒的末端蛋白。

5.根據權利要求1所述的一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，其特征在于，利用噬菌體Φ29的DNA聚合酶及其酶催化反應體系進行基因芯片上探針的合成，選其他DNA聚合酶也要選相應的DNA聚合酶酶催化反應體系。

6.根據權利要求1所述的一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，其特征在于，指導探針合成的模板通過連接臂固定微針上，能夠通過微針完成模板序列的轉移過程。

7.根據權利要求1所述的一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，其特征在于，在整個指導探針合成的模板通過連接臂固定微針上，能夠通過微針完成模板的轉移。

8.根據權利要求1所述的一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，其特征在于，利用連接臂克服探針合成過程中存在的空間位阻問題，充分保障DNA聚合酶原位合成基因芯片探針。

9.根據權利要求1所述的一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，其特征在于，利用升溫變性的方法完成新合成的探針序列與模板序列的解離，避免基因芯片移除過程中損傷探針序列。

10.根據權利要求1所述的一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法，其特征在于，可以利用微針上的模板快速、低成本地按堿基互補配對原則在基片上合成探針，能夠以類似復印的方式大量制造基因芯片。