[發明專利]一種伯克霍爾德菌及其應用

在審

• 申請號: 202011269503.0
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN112342163A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 任婧楠;彭芷芊;范剛;張璐璐;李曉;潘思軼
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/26;C12R1/01
• 代理公司: 廣東中科華海知識產權代理有限公司 44668
• 代理人: 常潔

本發明涉及微生物領域，具體是一種伯克霍爾德菌及其應用。首先經初篩，將樣品菌懸液稀釋涂布平板，挑取單菌落，以瓦倫西亞烯為唯一碳源，通過繪制生長曲線進行初篩，選擇生長良好的菌株進行下一步實驗；再經過復篩，將菌種對瓦倫西亞烯生物轉化生成圓柚酮的產量進行分析比較，選擇圓柚酮產量高的菌株進行下一步實驗；對選擇出的菌株進行劃線分離，將菌種對瓦倫西亞烯生物轉化的產物及含量進行分析測定。與現有的物理、化學合成法相比，具有高度專一性、反應條件溫和、反應速率快、收率高、成本低及反應步驟少等特點，且這樣生產的圓柚酮屬于天然香料，可以添加到食品、化妝品及其他家用產品中。

技術領域

本發明涉及微生物領域，具體是一種伯克霍爾德菌及其應用。

背景技術

圓柚酮是柚類香氣成分中重要的物質之一，其具有持久強烈的柑橘味香味，主要作為香料添加在食品和化妝品中。在香煙中添加一定量的圓柚酮，能夠增加卷煙香氣，豐滿卷煙香味，降低刺激；圓柚酮帶有甜的果皮、木香香韻，因此也可用于調配柚子、橙子、熱帶水果等食用香精。

天然圓柚酮主要存在于香檸檬油、圓柚油、檸檬油、柑橘油、白檸檬油和紅橘油等揮發油中。但其在精油中的天然含量一般較低，因而實際生產使用的圓柚酮主要來源于化學合成。最常見的合成方法是使用瓦倫西亞烯作為起始物質，使用重鉻酸鹽氧化瓦倫西亞烯，或在叔丁基過氧化氫(TBHP)存在下使用催化劑進行氧化。這些化學合成方法大量使用了重金屬催化劑，對環境有嚴重的破壞，其他一些能夠使用的非重金屬催化劑雖然不會破壞環境，但都有著較大的安全隱患，并且生產效率過低，無法適應生產的需求。

歐洲食品法規有明確規定，采用化學合成方法得到的圓柚酮產品不能作為一種天然香料進行銷售和使用，天然香料只能由物理過程(從天然原料中萃取) 或酶/微生物工藝來制備。微生物轉化是通過微生物細胞或酶對外源性底物進行結構修飾，也就是利用微生物代謝過程中產生的某個或某一系列酶對底物進行的催化反應，因此通過微生物轉化生產的香料也屬于天然香料。微生物轉化具有高度專一性、反應條件溫和、反應速率快、收率高、成本低及反應步驟少等特點。目前已被廣泛用于有機合成、新藥開發、體外代謝產物預測、香料生產等方面。

發明內容

本發明的目的是采用以瓦倫西亞烯為唯一碳源的篩選方法，高效準確地篩選出能夠轉化圓柚酮的菌株，將自然界中含量豐富、應用價值不高的瓦倫西亞烯轉化生產為香氣更濃、應用更為廣泛、商業價值更高的天然香料圓柚酮。

為實現上述發明目的，本發明提供一種伯克霍爾德菌，保藏編號為CCTCCNO：M2020510，其篩選方法如下：

(1)從湖北省柑橘工程技術研究中心取10g土樣，將土樣加到90g的滅菌生理鹽水中，混勻。

(2)取2mL混勻的液體于100mL最小培養基中，并添加1mL瓦倫西亞烯(0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存)，37℃，121r/min震蕩培養2-7天。

(3)將(2)獲得的菌液用滅菌后的生理鹽水稀釋至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、 10^-5和10^-6共6個稀釋梯度，將各個梯度菌液涂布平板分離菌種，37℃培養直至菌落完全生長。

(4)待(3)中菌落長出后，選擇適宜濃度的平板挑取單菌落，將單菌落接種于LB培養基中活化培養。

(5)初篩：取適量活化培養的菌液于最小培養基中，并添加1％瓦倫西亞橘烯(0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存)，37℃，210r/min下培養，每隔 12h測一次菌液OD₆₀₀值，繪制菌株的生長曲線。

(6)根據(5)繪制的生長曲線，選取生長良好的菌株轉接至LB培養基中活化培養。