[發明專利]一種伯克霍爾德菌及其應用

在審

• 申請號: 202011269503.0
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN112342163A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 任婧楠;彭芷芊;范剛;張璐璐;李曉;潘思軼
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/26;C12R1/01
• 代理公司: 廣東中科華海知識產權代理有限公司 44668
• 代理人: 常潔

1.一種伯克霍爾德菌，保藏編號為CCTCC NO：M2020510。

2.根據權利要求1所述的伯克霍爾德菌，其特征在于，16S rDNA如SIPO序列表所示。

3.根據權利要求1所述的伯克霍爾德菌在生產天然香料圓柚酮的應用。

4.一種保藏編號為CCTCC NO：M2020510的伯克霍爾德菌的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)從湖北省柑橘工程技術研究中心取10g土樣，將土樣加到90g的滅菌生理鹽水中混勻；

(2)取2mL混勻的液體于100mL最小培養基中，并添加1mL瓦倫西亞烯，37℃下震蕩培養2-7天；

(3)將(2)獲得的菌液用滅菌后的生理鹽水稀釋至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6共6個稀釋梯度，將各個梯度菌液涂布平板分離菌種，37℃培養直至菌落完全生長；

(4)待(3)中菌落長出后，選擇適宜濃度的平板挑取單菌落，將單菌落接種于LB培養基中活化培養；

(5)初篩：取適量活化培養的菌液于最小培養基中，并添加1％瓦倫西亞橘烯，37℃下震蕩培養，每隔12h測一次菌液OD₆₀₀值，繪制菌株的生長曲線；

(6)根據(5)繪制的生長曲線，選取生長良好的菌株轉接至LB培養基中活化培養；

(7)取1mL菌液于100mL LB培養基中，37℃下震蕩培養，當菌液OD₆₀₀值達到0.6-0.7時，添加0.1％瓦倫西亞橘烯，繼續培養至72h；

(8)復篩：分別取培養24h、48h、72h的發酵液進行SPME-GC-MS檢測分析，檢測菌種轉化生成圓柚酮的產量；

(9)選擇圓柚酮產量高的菌株進行平板劃線分離，連續分離3次。挑取平板上的單菌落于LB培養基中活化培養；

(10)取1mL菌液轉接至100mL LB培養基中，37℃下震蕩培養，當菌液OD₆₀₀值達到0.6-0.7時，添加0.1％瓦倫西亞橘烯，繼續培養至72h；

(11)分別取培養24h、48h、72h的發酵液進行SPME-GC-MS檢測，對轉化產物進行測定分析；

(12)參照《常見細菌系統鑒定手冊》通過形態學觀察菌株在固體培養基上的菌落形態，同時對菌株進行多項生理生化指標測定。

(13)提取菌株的DNA，進行16S rDNA的PCR擴增與測序，并進行菌株的同源性分析。

5.一種含有圓柚酮的香料，其特征在于，所述圓柚酮由保藏編號為CCTCC NO：M2020510的伯克霍爾德菌生物轉化得到的。

6.根據權利要求4所述的伯克霍爾德菌的篩選方法，其特征在于，所述的步驟(2)中最小培養基包括：6g/L Na₂HPO₄、0.50g/L NaCl、3g/L KH₂PO₄、1g/L NH₄Cl，并溶于0.85％生理鹽水中。

7.根據權利要求4所述的一種生物轉化生產天然香料圓柚酮的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中LB培養基成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl，溶于蒸餾水。

8.根據權利要求4所述的一種生物轉化生產天然香料圓柚酮的方法，其特征在于，所述的所有步驟操作均在無菌操作臺中進行。