[發明專利]一種金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的提取純化方法

在審

• 申請號: 202011268008.8
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN112646845A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 滄州碩金生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C08B37/00;C12R1/445
• 代理公司: 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696
• 代理人: 李笑磊

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的提取純化方法。本發明首先將金黃色葡萄球菌進行酚酸處理，接著利用高速珠磨法裂解細菌、促進莢膜多糖的釋放，然后利用季銨陽離子表面活性劑進行純化、最后經纖維素凝膠色譜柱進一步提純得到精制莢膜多糖，可以減少利用酚、氯仿、丙酮等造成的污染和對人體的傷害，安全環保，利用該方法制得的多糖不僅含量高產率和純度較高，蛋白質、核酸含量低，可直接作抗原而不經進一步修飾，或與蛋白質偶聯用于免疫接種。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的提 取純化方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌廣泛地分布于自然界，致病性的葡萄球菌常引起各種化膿性 疾患，如膿腫、敗血癥或膿毒敗血癥等。金黃色葡萄球菌之所以難以防治，是因 為在菌體的表面存在一層“保護膜”，即莢膜。有研究表明，莢膜幾乎存在于所 有金黃色葡萄球菌菌株的表面，可保護細菌免受抑菌或殺菌物質的侵害以及宿主 吞噬細胞的吞噬，同時還有助于細菌黏附于宿主細胞表面以誘發感染，是細菌得 以生存的重要表面結構。莢膜的主要成分為多糖，是細菌結構變化最少的表面抗 原之一，具有較好的免疫原性。據報道，94～100％的金黃色葡萄球菌都含有莢 膜，因此提取金黃色葡萄球菌莢膜多糖作為其疫苗的靶抗原已備受關注。目前， 已被鑒定的金黃色葡萄球菌有11個莢膜多糖血清型，其中70～80％的金黃色葡 萄球菌可產生5型多糖。

不論是莢膜多糖疫苗還是多糖蛋白結合疫苗的研制，莢膜多糖的提取與純化 是其中的關鍵步驟之一，細菌莢膜多糖疫苗的制備過程中需要盡可能多地去除雜 質蛋白和內毒素，以減少疫苗的副反應。目前，關于金黃色葡萄球菌莢膜多糖提 取的報道有很多，但提取方法各異。楊正濤等采用固體培養基對5型金葡菌莢膜 多糖進行培養，收集菌體經高壓裂解釋放莢膜多糖，但固體培養法不利于擴大生 產。利用酸處理雖然脫蛋白率高、但多糖損失嚴重；用苯酚抽提法去除雜蛋白， 用超速離心去除內毒素，但苯酚具有很強的毒性，有強烈的腐蝕性，對工作人員 的健康造成危害；苯酚對環境也具有嚴重的危害；用柱層析法去除雜蛋白純化莢 膜多糖，但此方法處理量小，成本高，不同細菌莢膜多糖的所需要的純化方法不 同，還沒有企業用于疫苗生產。

陽離子表面活性劑具有從低離子強度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特 性，在這種條件下，蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液里，在高離子強度的溶液里， 與蛋白質和大多數酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物，從而達到分離提純的目 的；而且對人體傷害小，易降解，在多糖分離提純中具有很大的前景。但單一的 純化方法制備得到的多糖純度低、且產量低。因此，開發一種安全、環保，并能 達到高細菌莢膜多糖得率、高純度的提取純化方法很有必要。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種金黃色葡萄球菌5型莢膜 多糖的提取純化方法，本發明方法利用季銨鹽陽離子表面活性劑進行純化，可以 減少利用酚、氯仿、丙酮等造成的污染和對人體的傷害，安全環保，利用該方法 制得的多糖不僅含量高產率和純度較高，蛋白質、核酸含量低，可直接作抗原而 不經進一步修飾，或與蛋白質偶聯用于免疫接種。

為實現上述目的，本發明采取下述技術方案。

一種金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的提取純化方法，所述方法包括以下步驟：

1)金黃色葡萄球菌的發酵培養：

在哥倫比亞血瓊脂基礎培養基中加入1.8～2.2％的NaCl，121℃高壓滅菌 10～20min后調節溫度至40～50℃，加入8～12％的新生牛血清制成瓊脂培養板； 在酒精燈火焰附近，用徹底燒灼的接種環將鑒定為5型莢膜多糖的金黃色葡萄球 菌種子液按0.8～1.2vol％的接種量接種到培養基上，在35～40℃、3～5％的CO₂的 生化培養箱中培養細菌不低于24h；

2)金黃色葡萄球菌莢膜多糖的粗提：