[發明專利]一種金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的提取純化方法

在審

• 申請號: 202011268008.8
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN112646845A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 滄州碩金生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C08B37/00;C12R1/445
• 代理公司: 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696
• 代理人: 李笑磊

1.一種金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的提取純化方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

1)金黃色葡萄球菌的發酵培養：

在哥倫比亞血瓊脂基礎培養基中加入1.8～2.2％的NaCl，高壓滅菌后調節溫度至40～50℃，加入8～12％的新生牛血清制成瓊脂培養板；將鑒定為5型莢膜多糖的金黃色葡萄球菌種子液按0.8～1.2vol％的接種量接種到培養基上，在35～40℃、3～5％的CO₂的生化培養箱中培養細菌不低于24h；

2)金黃色葡萄球菌莢膜多糖的粗提：

在培養基中加入5～10倍體積的經高壓滅菌的PBS緩沖液(pH＝7.2～7.5)并制得菌懸液，然后將菌懸液以1.8～2.5mg/mL懸浮于蒸餾水中，加入0.5～1.2％的酚酸，在80～120℃下處理1～1.5h，酚酸處理過后的菌懸液高速珠磨2～5min；然后用0.2μm的纖維膜進行過濾除去菌體雜質，取濾過液備用；

3)莢膜多糖的純化：

往步驟2)制備的濾過液中加入季銨鹽陽離子表面活性劑，邊加邊攪拌，0～4℃靜置過夜沉淀多糖，取沉淀用1～1.5mol/L的NaCl溶液解離；加入終濃度為70～95vol％的乙醇，收集沉淀，用去離子水復溶；復溶液以纖維素柱層析法分離，以質量比為7～9:2～2.5:1的乙醇、乙酸、水混合物作洗脫液，流速為0.8～1.4mL/min,示差檢測器在線檢測，按照洗脫峰收集，減壓濃縮混合，得到白色粉末狀物質即為精制莢膜多糖。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述步驟2)酚酸為對羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸。

3.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于，所述步驟2)高速珠磨過程中，每1mL菌懸液中加入0.3～0.5g研磨球，研磨球為三種不同尺寸混合，分別為0.1mm、0.2mm、0.4mm，且三種尺寸的研磨球重量比為10:5～8:2～5。

4.根據權利要求1～3任一項所述方法，其特征在于，所述步驟3)中所述季銨鹽陽離子表面活性劑為(十二烷基二甲基-2-羥丙基)-醋酸氯化銨或(十二烷基二甲基-2-羥丙基)-水楊酸氯化銨。

5.根據權利要求1～4任一項所述方法，其特征在于，所述季銨鹽陽離子表面活性劑經由下述方法制備得到：

將羧酸、十二烷基二甲基叔胺、鹵代烴混合按照1:1.5～3.5:2～2.5摩爾比混合，邊攪拌邊升溫至60～80℃，反應8～12h；反應結束后將產物用足量丙酮溶解，冷卻形成膏狀物，分離兩相；產物去除溶劑，50～60℃真空干燥10～24h，即得。

6.根據權利要求5所述方法，其特征在于，所述鹵代烴為環氧氯丙烷、環氧溴丙烷或環氧碘丙烷。

7.根據權利要求1～6任一項所述方法，其特征在于，所述步驟3)中洗脫液中還含有0.5～1％的十六烷基吡啶氯化銨。

8.根據權利要求1～7任一項所述方法，其特征在于，所述步驟3)中纖維素柱填料為葡聚糖纖維素或過葡聚糖纖維素。

9.一種金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖，其特征在于，由權利要求1～8任一項所述方法制備得到。

10.根據權利要求1～9任一項所述金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖在免疫接種中的應用，包括利用權利要求1～9任一項所述方法制備得到的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖直接作抗原而不經進一步修飾，或與蛋白質偶聯用于免疫接種。