[發明專利]用于提高CHO細胞的表達效率的CRISPR-Cas13d系統以及重組CHO細胞

有效

• 申請號: 202011266396.6
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN112342216B
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 丁麗華;葉棋濃;劉婕;張亞楠
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/22;C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;C12P21/00;C12R1/91
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 何葉喧

本發明公開了一種用于提高CHO細胞的表達效率的CRISPR?Cas13d系統以及采用該系統制備得到的重組CHO細胞。本發明提供了用于抑制AMPK基因表達的物質在促進CHO細胞表達外源蛋白中的應用。本發明保護sgRNA_AMPK?1，其靶序列結合區如序列3中第1至21位核苷酸所示。本發明保護一種特異重組質粒，其表達所述sgRNA_AMPK?1和Cas13d蛋白。本發明保護表達sgRNA_AMPK?1和Cas13d蛋白的重組慢病毒。本發明的發明人通過CRISPR/Cas13d系統有效抑制了CHO細胞中的AMPK基因表達，得到了重組CHO細胞,表達外源蛋白的能力極其顯著的提高,可以作為生物反應器大大提高生物制品的產量。本發明對于生物制藥領域具有巨大的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于提高CHO細胞的表達效率的CRISPR-Cas13d系統以及采用該系統制備得到的重組CHO細胞。

背景技術

生物制藥離不開細胞表達系統，而最常用的細胞系則是中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)表達系統。

1987年，基因泰克公司的tPA被FDA批準，這是第一個CHO細胞表達的上市藥品。之后，CHO細胞作為哺乳動物蛋白表達系統全面走入制藥行業。CHO細胞大規模培養技術及其生物反應器工程可廣泛應用于抗體、基因重組蛋白質藥物、病毒疫苗等生物技術產品的研究開發和工業化生產。

通過幾十年的發展，CHO細胞已成為生物技術藥物最重要的表達或生產系統，成為了基因工程和生物制藥的重要工具。2013年，在當年20個最暢銷的生物藥中，有11個是用CHO細胞表達的。據估計，如今用CHO細胞表達的藥品份額已經占到數千億美元。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于提高CHO細胞的表達效率的CRISPR-Cas13d系統以及采用該系統制備得到的重組CHO細胞。

本發明提供了用于抑制AMPK基因表達的物質在促進CHO細胞表達外源蛋白中的應用。

本發明還保護一種促進CHO細胞表達外源蛋白的方法，包括如下步驟：在CHO細胞中導入抑制AMPK基因表達的物質。在CHO細胞中導入抑制AMPK基因表達的物質的同時，可以導入表達外源蛋白的DNA分子。也可以先在CHO細胞中導入抑制AMPK基因表達的物質，得到重組細胞，再在重組細胞中導入表達外源蛋白的DNA分子。

以上任一所述抑制AMPK基因表達的物質為如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)用于降解AMPK基因的mRNA的物質；

(a2)基于CRISPR-Cas13d系統對AMPK基因的mRNA進行編輯的物質；

(a3)用于降低AMPK蛋白的豐度的物質。

基于CRISPR-Cas13d系統對AMPK基因的mRNA進行編輯的物質具體可為下述任一CRISPR-Cas13d系統。

本發明還保護一種sgRNA，命名為sgRNA_AMPK-1，其靶序列結合區如序列表的序列3中第1至21位核苷酸所示。具體來說，所述sgRNA_AMPK-1如序列表的序列3所示。

本發明還保護一種特異DNA分子，其轉錄得到所述sgRNA_AMPK-1。

本發明還保護一種特異重組質粒，其表達所述sgRNA_AMPK-1和Cas13d蛋白。