[發明專利]一種活細胞內檢測CLK3激酶活性的生物探針及其應用

有效

• 申請號: 202011261815.7
• 申請日: 2020-11-12
• 公開（公告）號: CN112444509B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 劉丹;曹旭;陳豐
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張瑩

本發明公開了一種活細胞內檢測CLK3激酶活性的FRET生物探針,所述生物探針包括一對能發生熒光共振能量轉移的熒光供體mTFP和熒光受體EYFP、能識別磷酸化標記的FHA2結構域、氨基酸序列為GGSGG的柔軟構象的連接子以及能被CLK3激酶磷酸化的多肽底物片段。該生物探針與體外酶反應相比能在活細胞內實時監測CLK3激酶活性，更能反映細胞內的真實酶活水平。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于熒光共振能量轉移的在活細胞內檢測CLK3激酶活性的生物探針，以及其在檢測CLK3激酶活性方面的應用。

背景技術

CLK3激酶，又稱雙特異性激酶即它既能磷酸化自身序列中的酪氨酸又可以磷酸化底物蛋白序列中的絲氨酸和蘇氨酸。CLK3激酶定位于細胞核，其主要功能是通過磷酸化剪切相關的絲氨酸/精氨酸重復蛋白來調控基因pre-mRNA的選擇性剪接，一旦失調則可能會引起疾病的發生。同時研究表明，在肝癌患者組織中CLK3表達量顯著升高，并且與肝癌患者的TNM分期以及不良預后相關。敲低CLK3后可以顯著抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移。另外，CLK3還在膽管癌、紅白血病等多種癌癥中表達上調，提示CLK3可作為癌癥治療的靶點進行研究。近年來，以激酶作為靶點開發高度特異的小分子抑制劑作為臨床藥物已然愈發成為一種趨勢，迄今為止FDA批準上市的激酶抑制劑類藥物高達百種。目前關于CLK3激酶結構域的高分辨率晶體結構已經被解出，這就為CLK3激酶抑制劑類藥物的開發提供了良好的基礎，進一步的篩選就依賴于CLK3激酶活性的高通量且特異性的檢測。

目前對于CLK3激酶活性的檢測多依賴于傳統的生化檢測方法，理論基礎為蛋白激酶以ATP為磷酸基團供體并將其γ-磷酸基團轉移到底物蛋白特定位點的羥基上。市面上的檢測試劑盒如碧云天的Kinase-Lumi^TM化學發光法激酶活性檢測試劑盒、普洛麥格的ADP-Glo^TM激酶檢測試劑盒等，它們或檢測體外酶反應過程中ATP的剩余量，或檢測酶反應過程中ADP的生成量，借助ATP依賴的螢光素酶催化的螢光素發光反應通過測定化學發光來定量激酶的活性。此類方法缺點在于操作復雜且需體外純化激酶與激酶底物，使得酶的穩定性無法保證，而且體外無法完全模擬細胞內復雜的微環境，激酶反應所依賴的溫度、pH、緩沖體系等都會影響酶反應。因此，體外實驗的準確性有待考量。此外，酶活檢測還涉及質譜分析、放射性同位素標記和蛋白免疫印跡法等檢測方法。其中在質譜檢測過程中，對樣品純度要求較高，而且因為質譜檢測本身存在覆蓋率較低的問題，再加上磷酸肽與非磷酸化的肽相比占比低，故而覆蓋不到的可能性極大；在放射性同位素標記法中，不僅耗費貴而且產生的放射性同位素垃圾存在較大的安全隱患；蛋白免疫印跡法則僅適用于檢測已存在磷酸化抗體的多肽底物，但是并不是所有的磷酸化多肽底物都有現成的抗體，專一抗體的生產需要耗費大量時間，代價較高。由于CLK3目前僅能體外檢測酶活，針對體外各種檢測技術的不足，基于熒光共振能量轉移的體內檢測CLK3激酶活性的方法有著良好的應用前景。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，填補活細胞內檢測CLK3酶活方法的空白，提供一種特異性強、廉價高效的活細胞內實時定量檢測CLK3激酶活性的FRET生物探針及其用途。

為實現上述目的，本發明制備了一種活細胞內檢測CLK3激酶活性的FRET生物探針，所述生物探針包括一對能發生熒光共振能量轉移的熒光供體mTFP和熒光受體EYFP、能識別磷酸化標記的FHA2結構域、氨基酸序列為GGSGG的柔軟構象的連接子以及能被CLK3激酶磷酸化的多肽底物片段。

進一步地，所述mTFP表示青色熒光蛋白的一種變體，在亮度上超越ECFP，所述EYFP表示增強型黃色熒光蛋白。當這對熒光基團距離足夠近時，用445nm的激發光去激發mTFP時，其發射光可以激發EYFP進而產生熒光共振能量轉移現象，計算EYFP熒光強度/mTFP熒光強度所得到的熒光強度比值可以對這一過程進行量化。

進一步地，所述能被CLK3激酶磷酸化的多肽底物片段的氨基酸序列為RSRSRSWTRSRSRSR。