[發(fā)明專利]血液中游離miRNA文庫制備和表達定量的方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011260858.3
• 申請日: 2020-11-12
• 公開（公告）號: CN112359093B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發(fā)明（設計）人: 李華;謝躍華;胡文獻;胡傳圣
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州京脈生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06;G16B40/10;G16B30/00
• 代理公司: 江蘇昆成律師事務所 32281
• 代理人: 劉尚軻

本申請涉及血液中游離miRNA文庫制備的方法及試劑盒，主要包括步驟：(a)從血液中分離血清或者血漿，提取游離RNA；(b)將所述游離RNA與外源RNA混合，外源RNA序列中任意一部分均不與已知的人/大鼠/小鼠的miRNA序列重合；(c)將步驟(b)中的RNA混合物加接頭、反轉(zhuǎn)錄第一鏈、第二鏈合成及擴增，回收目標DNA片段，獲得游離miRNA測序文庫。還涉及miRNA表達定量的方法，所述方法包括上述的步驟(a)、(b)和(c)，以及：將所述miRNA測序文庫進行二代測序和數(shù)據(jù)分析，在數(shù)據(jù)分析中，可利用銜接子RA5的S2隨機標簽序列作為定量化標簽，去除PCR重復序列，提高檢測的準確性。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體地，涉及血液中游離miRNA文庫制備和表達定量的方法及試劑盒。

背景技術

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為19-25個核苷酸的非編碼短RNA，它能夠通過與靶基因mRNA的3 'UTR完全或不完全配對，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯。過去的研究表明miRNA在細胞內(nèi)發(fā)揮重要的生物學功能，參與了多種調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖與死亡、等等。

目前miRNA研究中最令人關注的領域之一就是對血液（血清或血漿）樣本中存在的游離miRNA進行檢測和定量。這些在血液中存在的相對穩(wěn)定的游離miRNA引起了研究人員的極大興趣，因為miRNA水平變化可作為潛在的多種疾病的無創(chuàng)性分子標志物。通過從血清或血漿中純化RNA，研究發(fā)現(xiàn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展與某些游離miRNA的特定表達緊密相關。目前，高通量測序在對游離miRNA的研究及分析中，發(fā)揮著至關重要的作用。

目前市場上用于miRNA高通量文庫制備的主流試劑盒，如Illumina公司TruSeq 小RNA文庫制備試劑盒和NEB公司的NEBNext Multiplex 小RNA建庫試劑盒，雖然難度和成本較低，但對RNA的起始用量要求都在100ng以上。血液中游離miRNA的含量較低，通常100μl的全血提取出的游離RNA量約為0.2ng–3.5ng，遠達不到建庫試劑盒對起始量的要求，因此無法采用該類試劑盒構(gòu)建文庫；通過增加取血量可以提取到足夠的RNA，但可能會對受測者造成了一定的負擔。因此，為了實現(xiàn)對微量血液中游離miRNA的高通量測序及數(shù)據(jù)分析，需要建立一種微量血液游離miRNA的文庫制備與數(shù)據(jù)分析方法以及對應的試劑盒，以便滿足實際需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供血液中游離miRNA文庫制備、表達定量的方法及試劑盒，適用于血液（包括微量血液）游離miRNA的文庫構(gòu)建、二代測序及數(shù)據(jù)分析。

本申請的第一方面，涉及一種血液中游離miRNA文庫制備的方法，所述方法包括步驟：

（a）從血液中分離血清或者血漿，提取游離RNA；

（b）將所述游離RNA與外源RNA混合，外源RNA序列中任意一部分均不與已知的人/大鼠/小鼠的miRNA序列重合;

（c）將步驟（b）中的RNA混合物加接頭、反轉(zhuǎn)錄第一鏈、第二鏈合成及擴增，回收目標DNA片段，獲得游離miRNA測序文庫。

在一些實施方式中，在步驟（a）中，全血樣品的總體積為100μl–1ml，所述血液樣品根據(jù)抗凝與否提取對應的血漿或者血清。

進一步的，從血漿或血清中提取200pg–20ng游離RNA。

在一些實施方式中，在步驟（b）中，外源RNA的長度為50nt–1000nt。

進一步的，外源RNA的長度為100nt–200nt，濃度為10ng/μl，外源RNA為人工合成的序列。外源RNA與游離RNA按照任意比例混合，使得混合后的RNA總量超過10ng。

在一些實施方式中，步驟（c）包括：