[發明專利]血液中游離miRNA文庫制備和表達定量的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202011260858.3
• 申請日: 2020-11-12
• 公開（公告）號: CN112359093B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 李華;謝躍華;胡文獻;胡傳圣
• 申請（專利權）人: 蘇州京脈生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06;G16B40/10;G16B30/00
• 代理公司: 江蘇昆成律師事務所 32281
• 代理人: 劉尚軻

1.血液中游離miRNA文庫制備的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：（a）從血液中分離血清或者血漿，提取游離RNA；從血漿或血清中提取200pg–20ng游離RNA；（b）將所述游離RNA與外源RNA混合，外源RNA序列中任意一部分均不與已知的人/大鼠/小鼠的miRNA序列重合; 外源RNA的長度為100nt–200nt，外源RNA為人工合成的序列，外源RNA與游離RNA按照任意比例混合，使得混合后的RNA總量超過10ng；（c）將步驟（b）中的RNA混合物加接頭、反轉錄第一鏈、第二鏈合成及擴增，回收目標DNA片段，獲得游離miRNA測序文庫；將所述RNA混合物與銜接子RA3進行連接反應，銜接子RA3與RNA的3’端連接，形成核酸-銜接子RA3復合物；將所述核酸-銜接子RA3復合物與銜接子RA5進行連接反應，所述銜接子RA5與所述RNA的5’端連接，形成銜接子RA5-核酸-銜接子RA3復合物；將所述銜接子RA5-核酸-銜接子RA3復合物與反轉錄引物混合，進行反轉錄反應，得到DNA第一鏈；將所述DNA第一鏈與特異性結合于RA3的引物和特異性結合于RA5的引物進行混合，獲得擴增產物；將所述擴增產物進行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠塊經染色后在紫外燈下識別各DNA條帶，割取所需的目標DNA片段并回收，得到制備完成的miRNA測序文庫；其中，所述銜接子RA3的序列為SEQ ID NO:1，所述銜接子RA5的序列包括固有結構S1-S2-S3，S1的序列為SEQ ID NO:2，S2是隨機標簽序列，是長度為11～15個堿基的隨機核苷酸序列，S3是長度為4個堿基的固定序列，S3為ACGA、CCGA、CGAU、CGUA、CGUU、GACG、GCCA、GCGU、GGAA、GUCG、GUCU中的一種；反轉錄引物為能夠特異性結合于銜接子RA3的反轉錄引物RT Primer，RT Primer的序列從5’端到3’ 端為：CCTTGGCACCCGAGAATTCCA，能夠特異性結合于銜接子RA3的引物為Primer1，Primer1的序列從5’端到3’ 端為：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA，能夠特異性結合于銜接子RA5的引物為Primer2，Primer2的序列從5’端到3’ 端為：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA，其中Primer1序列中標下劃線的8個堿基“GTCGTGAT”為index序列，所述index序列可用以下十種index序列替換：ACCACTGT、TGGATCTG、CCGTTTGT、TGCTGGGT、GAGGGGTT、AGGTTGGG、GTGTGGTG、TGGTCACA、TTGACCCT、CCACTCCT；所述目標DNA片段對應了miRNA，所述目標DNA片段的長度為miRNA的長度+測序接頭的長度+S2的長度+S3的長度，其中，所述miRNA的長度為15～30bp，測序接頭的長度為120bp，S2的長度為11～15bp，S3的長度為4bp。

2.血液中游離miRNA表達定量的方法，其特征在于，所述方法包括權利要求1所述的步驟（a）、步驟（b）和步驟（c），還包括如下步驟：（d）將所述miRNA測序文庫進行二代測序，獲得下機數據；（e）通過質控工具對所述下機數據進行數據質控和預處理，得到去除了低質量序列和測序接頭的有效數據，將所述銜接子RA5中的S2隨機標簽序列以及S3固定堿基，從有效數據的序列5’端移除，再將其與人類參考基因組序列比對，獲得定位于所述人類參考基因組序列的位置信息；（f）利用所述位置信息以及對應的所述S2隨機標簽序列，對PCR重復序列進行去除，再將獲得的已去除PCR重復的序列的位置與所述人類參考基因組中的miRNA位置相比較，確定樣本中所有的miRNA的表達量。