[發明專利]一種高產β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的選育方法

在審

• 申請號: 202011260115.6
• 申請日: 2020-11-12
• 公開（公告）號: CN112375755A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 孫智;龔大春;郭金玲;古永紅;劉君子;肖玲玲;文曉敏;任之光;羅莉;李方橋;黃啟亮
• 申請（專利權）人: 湖北三峽職業技術學院
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12Q1/04;G01N33/573;C12N9/42;C12R1/685
• 代理公司: 重慶金橙專利代理事務所(普通合伙) 50273
• 代理人: 李梅

本發明公開了一種高產β?葡萄糖苷酶的黑曲霉的選育方法，一種高產β?葡萄糖苷酶的黑曲霉的選育方法包括如下步驟：首先配置培養基及試劑，再活化出發菌種，再對種子進行培養，然后液體發酵培養，再制備單孢子菌懸液，確定最佳誘變時間之后進行對菌株進行ARTP誘變，將誘變得到的菌株進行高通量初篩和搖瓶復篩,最后將得到的高產菌株進行遺傳穩定培養。本方法選用黑曲霉作為出發菌株，相較發酵周期更短、β?葡萄糖苷酶產量更高；采用ARTP誘變技術，相較于傳統誘變技術，本方法具有操作簡便、成本低、無有毒有害物質參與誘變過程等優點；通過p?NPG比色法和DNS法相結合的方法進行高產菌株的篩選，得到的高產菌株更加適合工業化發酵生產β?葡萄糖苷酶。

技術領域

本發明涉及一種黑霉素的選育方法，具體為一種高產β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的選育方法，屬于纖維素酶水解技術領域。

背景技術

β-葡萄糖苷酶是一種纖維素酶類水解酶，廣泛存在于各類生物體中，作用于芳基或羥基與糖基原子團之間的糖苷鍵，生成β-D－葡萄糖及相應配基。β-葡萄糖苷酶是纖維素酶中的一種，可促進纖維二糖的水解，提高纖維素酶系的水解活性，在纖維素降解過程中發揮著關鍵作用，如果缺少β-葡萄糖苷酶就會造成纖維二糖的大量積累，而纖維二糖的大量積累又會對纖維素酶的酶解形成強烈的反饋抑制，所以增強纖維素酶體系中β-葡萄糖苷酶的活力是提高纖維素水解效率和增加葡萄糖產量的關鍵，為了更好地對β-葡萄糖苷酶發酵工藝和酶學特性開展研究，需要一種提取大量且酶活性高的β-葡萄糖苷酶的方法。

提取β-葡萄糖苷酶的現有技術主要有三種，方法一是從各種植物和微生物中分離純化出β-葡萄糖苷酶，但通過該方法提取的β-葡萄糖苷酶，其酶活力較低、成本高；方法二是利用微生物發酵來生產β-葡萄糖苷酶，但該方法篩選得到的產酶菌株大部分產酶量較低；方法三是通過傳統誘變技術選育出β-葡萄糖苷酶高產菌株，雖然該方法使野生型菌株的產酶水平有了很大幅度的提高,但是,到目前為止,仍未選育出能夠適合于工業化發酵生產β-葡萄糖苷酶的菌株。

發明內容

本發明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種高產β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的選育方法，其特征在于：所述一種高產β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的選育方法包括如下步驟：

S1、培養基及試劑的配制，準備斜面培養基、種子培養基、初篩培養基、液體發酵培養基、葡萄糖標準溶液、緩沖溶液、水楊苷溶液、適量的DNS試劑以及相應的實驗儀器。

S2、出發菌種的活化，將保藏的黑曲霉菌種劃線接種于PDA培養基上，置于培養箱中28℃恒溫培養96h。

S3、種子培養，取一環新鮮成熟的斜面培養基上的孢子，接入50mL種子培養基中，在28℃恒溫搖床中，以180r/分鐘的轉速培養種子液24h。

S4、液體發酵培養，取發酵好的種子培養基，按照10％的接種量，將種子液接入250mL裝有50mL液體發酵培養基的錐形瓶中，在30℃、180r/分鐘的條件下進行培養。

S5、制備單孢子菌懸液，將培養成熟的種子試管斜面加入5mL無菌生理鹽水，用接種環輕輕地將孢子刮下，裝入裝有玻璃珠的100mL錐形瓶中，25℃150r/分鐘震蕩30分鐘。然后用滅菌后的脫脂棉將錐形瓶中的菌液過濾，制得單孢子懸浮液。通過血球板計數，最終將孢子液制成濃度約為10⁶個/mL的混懸液。

S6、確定最佳誘變時間，將出發菌株分別處理1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘，將誘變后的菌懸液涂布在PDA平板上，以28℃的溫度在恒溫培養箱中培養4-5天，待長出菌落后，通過菌落數計算菌株的致死率，并繪制出致死率曲線，然后根據不同誘變時間對黑曲霉的ARTP致死率影響，確定最佳誘變時間。

S7、ARTP誘變，用移液槍吸取10微升單孢子菌懸液滴加至載片中央，用無菌鑷子將載片放于ARTP系統操作室旋轉臺上的對應孔位，并對其進行ARTP誘變處理，誘變時間為S8所確定的最佳誘變時間。