[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的選育方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011260115.6
• 申請(qǐng)日: 2020-11-12
• 公開（公告）號(hào): CN112375755A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫智;龔大春;郭金玲;古永紅;劉君子;肖玲玲;文曉敏;任之光;羅莉;李方橋;黃啟亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/01
• 分類號(hào): C12N15/01;C12N13/00;C12Q1/04;G01N33/573;C12N9/42;C12R1/685
• 代理公司: 重慶金橙專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50273
• 代理人: 李梅

1.一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的選育方法，其特征在于：所述一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的選育方法包括如下步驟：

S1、培養(yǎng)基及試劑的配制，準(zhǔn)備斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、初篩培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、緩沖溶液、水楊苷溶液、適量的DNS試劑以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)儀器；

S2、出發(fā)菌種的活化，將保藏的黑曲霉菌種劃線接種于PDA培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)96h；

S3、種子培養(yǎng)，取一環(huán)新鮮成熟的斜面培養(yǎng)基上的孢子，接入50mL種子培養(yǎng)基中，在28℃恒溫?fù)u床中，以180r/分鐘的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)種子液24h；

S4、液體發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵好的種子培養(yǎng)基，按照10％的接種量，將種子液接入250mL裝有50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30℃、180r/分鐘的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

S5、制備單孢子菌懸液，將培養(yǎng)成熟的種子試管斜面加入5mL無(wú)菌生理鹽水，用接種環(huán)輕輕地將孢子刮下，裝入裝有玻璃珠的100mL錐形瓶中，25℃150r/分鐘震蕩30分鐘。然后用滅菌后的脫脂棉將錐形瓶中的菌液過(guò)濾，制得單孢子懸浮液。通過(guò)血球板計(jì)數(shù)，最終將孢子液制成濃度約為10⁶個(gè)/mL的混懸液；

S6、確定最佳誘變時(shí)間，將出發(fā)菌株分別處理1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘，將誘變后的菌懸液涂布在PDA平板上，以28℃的溫度在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5天，待長(zhǎng)出菌落后，通過(guò)菌落數(shù)計(jì)算菌株的致死率，并繪制出致死率曲線，然后根據(jù)不同誘變時(shí)間對(duì)黑曲霉的ARTP致死率影響，確定最佳誘變時(shí)間；

S7、ARTP誘變，用移液槍吸取10微升單孢子菌懸液滴加至載片中央，用無(wú)菌鑷子將載片放于ARTP系統(tǒng)操作室旋轉(zhuǎn)臺(tái)上的對(duì)應(yīng)孔位，并對(duì)其進(jìn)行ARTP誘變處理，誘變時(shí)間為S8所確定的最佳誘變時(shí)間；

S8、高通量初篩，將制備好的單孢子菌懸液利用ARTP在最佳誘變時(shí)間下誘變后，利用微液滴器接種在裝有種子培養(yǎng)基的24微孔板中，于30℃，200r/分鐘條件下培養(yǎng)12h，然后在無(wú)菌條件下，取培養(yǎng)好的種子液10L加入含有底物p-NPG的發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)48h,并噴灑Na₂CO₃，最后挑選有明顯黃色圈的菌落，作為高產(chǎn)菌株進(jìn)入下一輪篩選中；

S9、酶的活性驗(yàn)證，將上述96孔微孔板在4000r/分鐘的條件下離心，取上清液5L稀釋了適當(dāng)倍數(shù)的粗酶液，于50℃水浴預(yù)熱10分鐘，然后加入100L已預(yù)熱10分鐘的5mmol/Lp-NPG溶液，10分鐘后再立即加入1mol/L的Na₂CO₃溶液200L直至終止反應(yīng)，再將其放置5分鐘，最后利用酶標(biāo)儀測(cè)出吸光值；

S10、搖瓶復(fù)篩，將高通量初篩的高產(chǎn)菌株進(jìn)行平板劃線分離純化后，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，通過(guò)DNS法來(lái)測(cè)定所篩選菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活的能力，酶活大的菌株即為高產(chǎn)菌株；

S11、遺傳穩(wěn)定培養(yǎng)，將高產(chǎn)菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)10代，再進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)β一葡萄糖苷酶的黑曲霉的選育方法，其特征在于：所述S1中的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，且所述PDA培養(yǎng)基由200g馬鈴薯、20g瓊脂以及20g葡萄糖配置而成，所述種子培養(yǎng)基由0.5g磷酸二氫鉀、10g硫酸銨、1g七水硫酸鎂以及10g葡萄糖配置而成，所述初篩培養(yǎng)基由固含量為20％的土豆汁、濃度為2％的蔗糖、滅菌冷卻后的p-NPG配置而成，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由20g麩皮、1g硫酸銨、2g磷酸二氫鉀、0.2g七水硫酸鎂以及0.2g七水硫酸亞鐵配制而成，所述初篩培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基均保持自然PH，無(wú)需調(diào)PH值。