[發明專利]一種肺癌早期檢測的標志物、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202011258891.2
• 申請日: 2020-11-12
• 公開（公告）號: CN112301130B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 李華;胡延平;郭子文;沈益行
• 申請（專利權）人: 蘇州京脈生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12N15/113
• 代理公司: 江蘇昆成律師事務所 32281
• 代理人: 劉尚軻

1.一種用于肺癌早期檢測的標志物的檢測試劑，所述標志物為來自人體血清的miRNA標志物組合，其特征在于，所述檢測試劑針對性檢測的人體血清miRNA標志物組合包括：hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-2276-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-3152-3p、hsa-miR-448、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-328-3p和hsa-miR-636。

2.如權利要求1所述的用于肺癌早期檢測的標志物的檢測試劑，其特征在于，所述miRNA標志物為血清中成熟的miRNA，所述肺癌早期指臨床上確診為I期和II期的非小細胞肺癌，所述miRNA標志物能夠區分肺癌早期患者與健康人，也能夠區分肺癌早期患者與慢性阻塞性肺疾病患者。

3.如權利要求2所述的用于肺癌早期檢測的標志物的檢測試劑，其特征在于，所述miRNA標志物的表達量RPM，在肺癌早期患者與健康人之間具有統計學顯著差異；將肺癌早期患者和健康人的血清樣本組成訓練組，樣本經過二代測序及數據分析，基于在肺癌早期患者血清樣本與健康人血清樣本之間有顯著差異表達的miRNA，使用回歸分析確定具有統計學顯著性的miRNA作為標志物。

4.如權利要求3所述的用于肺癌早期檢測的標志物的檢測試劑，其特征在于，包括步驟：

（A）肺癌早期患者和健康人的血清樣本組成訓練組，樣本分別經過文庫制備及二代測序，通過與人類參考基因組中的miRNA的位置進行比較，確定樣本中每個miRNA的表達量；

（B）基于樣本中每個miRNA的表達量，使用R語言edgeR包找到肺癌早期患者血清樣本與健康人血清樣本相比，在前者中有顯著高表達的miRNA；

（C）將miRNA的表達量RPM作為自變量，使用R語言stats包進行邏輯回歸建模，最終確定系數具有統計學顯著性的miRNA作為標志物；

還包括步驟：

（D）將肺癌早期患者和健康人的血清樣本組成驗證組1和驗證組2，多次驗證所述miRNA標志物對肺癌早期患者的診斷及區分效果，從而確定所述miRNA標志物的可靠性；

（E）將肺癌早期患者和慢性阻塞性肺疾病患者的血清樣本組成驗證組3，驗證所述miRNA標志物能夠可靠區分肺癌早期患者與慢性阻塞性肺疾病患者；

其中，在步驟（A）中，獲得樣本中每個miRNA的表達量RPM，包括步驟：

（A1）樣本經過文庫制備及二代測序后，通過質控工具對下機數據進行數據質控和預處理，得到去除了低質量序列和測序接頭的有效數據；

（A2）將銜接子RA5中的S2隨機標簽序列以及S3固定堿基，從有效數據的序列5’端移除，再將其與人類參考基因組序列比對，獲得定位于所述人類參考基因組序列的位置信息；

（A3）利用所述位置信息以及對應的所述隨機標簽序列，對PCR重復序列進行去除，再將獲得的已去除PCR重復的序列的位置與所述人類參考基因組中的miRNA位置相比較，確定測試樣本中每個miRNA的表達量RPM，某個miRNA的表達量RPM為該miRNA測序序列的總量占該樣品所有可比對至人類參考基因組的測序序列總量的百萬分比；

其中，在步驟（A3）中，比對到參考基因組同一位置的序列，若帶有相同的隨機標簽序列S2，則視為PCR重復，并將其合并為同一條序列；miRNA位置信息取自于miRBase數據庫，當某序列的5’端與某miRNA的5’端位置一致時，此序列記為此miRNA的測序序列；

所述銜接子RA5與miRNA的5’端連接，銜接子RA5的序列包括固有結構S1-S2-S3，S2為隨機標簽序列，S3為固定堿基序列，銜接子RA5的S1的序列為SEQ ID NO:2，S2為長度為11～15個堿基的隨機核苷酸序列，S3為長度為4個堿基的固定序列；所述S3選自：ACGA、CCGA、CGAU、CGUA、CGUU、GACG、GCCA、GCGU、GGAA、GUCG、GUCU中的一種。