[發明專利]一種抗酸脅迫能力提高的大腸桿菌工程菌及其應用

有效

• 申請號: 202011258755.3
• 申請日: 2020-11-12
• 公開（公告）號: CN112391329B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 張娟;楊謹華;堵國成;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/60;C12P7/56;C12P7/54;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開一種抗酸脅迫能力提高的大腸桿菌工程菌及其應用，屬于微生物工程技術領域。本發明在大腸桿菌中過表達天冬氨酸氨基甲酰基轉移酶催化亞基PyrB、二氫乳清酸脫氫酶PyrD、Orotidine?5'?磷酸脫羧酶蛋白PyrF成功構建了一類可廣泛應用于制備食品、藥品、飼料以及化學品的抗酸脅迫能力提高的大腸桿菌工程菌；相較于對照菌株，本發明提供的重組菌株對衣康酸、D?乳酸、琥珀酸的脅迫抗性均得到了顯著提高。本發明的操作簡單，可廣泛的應用到工業生產中。

技術領域

本發明涉及一種抗酸脅迫能力提高的大腸桿菌工程菌及其應用，屬于微生物工程技術領域。

背景技術

大腸桿菌是原核生物中一種重要的宿主菌。這類細菌在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性。它們不僅是研究生化、遺傳、分子生物學和基因工程的理想材料，在理論上具有重要的學術價值，而且在工業、農牧業、食品和醫藥等與人類生活密切相關的重要領域應用價值也極高。目前，已有多種高價值的有機酸生物發酵方法成功應用，其中也有人嘗試以大腸桿菌為宿主來表達，但是常常存在酸脅迫的問題。

高光學純度D-乳酸(97％以上)作為一個手性中心是多種手性物質的前體，是重要的手性中間體與有機合成原料，廣泛應用于制藥、高效低毒農藥及除草劑、化妝品等領域的手性合成，并且D-乳酸也是生物塑料聚乳酸的原料。目前發酵法制備乳酸以其綠色、高效、環保，在工業上具有廣泛的應用前景，雖然在大腸桿菌中有固有的乳酸生成途徑，可通過乳酸脫氫酶(LdhA)將丙酮酸轉化為乳酸，不需要額外引入異源LdhA來產生乳酸，但是由于大腸桿菌系統存在酸脅迫的問題，而制約著乳酸的產量的提高。

琥珀酸作為具有巨大潛力的前提物質，可以用來生產四氫呋喃等各種衍生物，在2010年被評估為“該化合物或技術已在文獻中引起極大關注，具有強大的平臺潛力、產品或技術的規模正在逐步擴大，以進行試點，演示或全面推廣”，琥珀酸及其直接衍生物的市場潛力預計每年高達245×103噸，而琥珀酸衍生的聚合物的市場規模估計高達每年25×106噸。在傳統的工程菌株發酵工藝中，琥珀酸是由曼海姆氏琥珀酸桿菌Mannheimiasucciniciproducens等發酵生產，產量約為68.41g·L^-1。這類菌株是自然存在的可以代謝產生琥珀酸，也已具有較高的產量，但是這類菌株的一個共性問題是他們的代謝改造相對來說較為復雜和困難，通常來說營養缺陷型的菌株在發酵時需要更多的營養添加物質，造成了無法實現大規模的工業應用，所以研究者們又將目光瞄準了大腸桿菌。

衣康酸學名為甲叉琥珀酸、亞甲基丁二酸，是不飽和二元有機酸，它含不飽和雙鍵，具有活潑的化學性質，可進行自身間的聚合，也能與其他單體如丙烯腈等聚合，是化學合成工業的重要原料，也是化工生產的重要原料。采用大腸桿菌作為天然宿主時，由于大腸桿菌本身不具備衣康酸代謝能力，起初被報道出來的產量非常低，少于1g·L^-1，后來發展到4.3g·L^-1。直到最近，可見的報道中，衣康酸最高的產量也僅僅為47g·L^-1，其合成途徑主要由烏頭酸氧化途徑產生，從最終的產量上來，仍然與采用曲霉菌屬為宿主時的產量有一定差距，其產率為0.86g·h^-1·L^-1，雖然與傳統的曲霉類生產菌屬相比，在產量上存在一些不足，但以大腸桿菌作為衣康酸的生產宿主依然可以被認為是具有潛力的。

但是大腸桿菌本身存在對有機酸耐受性不高的限制發展因素，大腸桿菌適應生長環境為中性，可乳酸生產環境的pH值適宜在pH?5.5以上，但約50g·L^-1的有機酸即會使環境pH降低至pH?2.0左右，這對大腸桿菌的生長是一種考驗。

對于酸脅迫，為維持大腸桿菌發酵生產目的蛋白的穩定性并提高生產效率，過去，工業上常常通過在大腸桿菌發酵的過程中添加外源中和劑來維持pH處于穩定的范圍，例如，通過添加堿性物質(碳酸鈣)來控制發酵環境的pH值。然而，堿性物質的添加往往會導致副產物的積累，而副產物中形成的鹽類會再次導致細胞處于高滲的環境，從而造成滲透壓脅迫的產生，再次影響菌體的生長與代謝。