[發(fā)明專利]一種尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA定量檢測用引物組

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011258091.0
• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112280833A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊潔;常慶;沈麗娟;侯劍剛;彭曉瓊;錢瑋;王政平
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院(上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院;上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院嘉定分院)
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 上海太優(yōu)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31352
• 代理人: 周長興

一種尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA定量檢測用引物組，由外引物對F3/B3、內(nèi)引物對FIP/BI和環(huán)引物對環(huán)F/環(huán)B組成；還涉及采用上述引物組的快速定量檢測方法；還涉及包含上述引物組的快速定量檢測試劑盒。本發(fā)明的檢測方法和試劑盒操作簡便、快速準(zhǔn)確、易推廣，具有較高的靈敏度，不需要昂貴儀器，能夠在現(xiàn)場病原體及基層醫(yī)院檢測中使用，對尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌的監(jiān)測與控制具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA快速定量檢測用引物組。

本發(fā)明還涉及利用上述的引物組快速定量檢測尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA的方法。

本發(fā)明還涉及利用上述引物組快速定量檢測尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA的試劑盒。

背景技術(shù)

目前，尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌(俗名大腸桿菌，革蘭氏陰性短桿菌)DNA定量檢測的傳統(tǒng)方法的主要缺點包括對微生物實驗室的要求，并且微生物培養(yǎng)周期長達(dá)48小時后才可進(jìn)行鑒定和量化。PCR分析需要具有昂貴儀器的分子生物學(xué)實驗室，其以熱循環(huán)儀的形式提供PCR所需的溫度曲線。此外，qPCR獲得的數(shù)據(jù)必須使用復(fù)雜的計算機(jī)軟件進(jìn)行分析，并由經(jīng)過培訓(xùn)的人員進(jìn)行解釋。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA定量檢測用引物組。

本發(fā)明的又一目的是提供一種利用上述引物組快速定量檢測尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA的方法。

本發(fā)明的再一目的是提供一種利用上述引物組快速定量檢測尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA的試劑盒。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA定量檢測用引物組，每個引物組由外引物對F3/B3、內(nèi)引物對FIP/BI和環(huán)引物對環(huán)F/環(huán)B組成，F(xiàn)3、B3、FIP、BI、環(huán)F、環(huán)B具體如下：

本發(fā)明提供的利用上述引物組快速定量檢測尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA的方法，包括以下步驟：

1)提取DNA；

2)配制LAMP檢測反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包括引物F3、B3、FIP、BI、環(huán)F、環(huán)B；

3)將提取的DNA加入引物組和LAMP檢測反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，肉眼觀察濁度，或利用實時濁度儀實時監(jiān)測核酸擴(kuò)增反應(yīng)過程，以圖文形式顯示整個反應(yīng)過程中各個反應(yīng)的速率和時間。

所述的方法，其中，步驟1提取DNA，是將導(dǎo)尿管表面的擦拭棉簽以分子級無DNA酶無菌水中洗滌兩次，16,000×g離心5分鐘，將沉淀重新懸浮并在分子級無DNA酶無菌水中洗滌兩次，99℃加熱15分鐘，以16,000×g離心5分鐘以沉淀細(xì)胞碎片，將上清液用作LAMP測定。

所述的方法，其中，步驟2的LAMP檢測反應(yīng)體系為：Bst DNA聚合酶4U、dNTPs200μM、甜菜堿0.8M、MgSO₄2mM、DNA熒光染料、緩沖液、蒸餾水。

所述的方法，其中，步驟3的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)是將DNA抽提液2ul加入引物組8ul和LAMP檢測反應(yīng)體系15ul于65度擴(kuò)增60分鐘。

本發(fā)明提供的利用上述引物組快速定量檢測尿?qū)Ч鼙砻娲竽c埃希菌DNA的試劑盒，所述試劑盒至少包括含有上述引物組上述LAMP檢測反應(yīng)體系。

所述的快速定量檢測試劑盒，其中，LAMP檢測反應(yīng)體系為：Bst DNA聚合酶4U、dNTPs200μM、甜菜堿0.8M、MgSO₄2mM、DNA熒光染料、緩沖液、蒸餾水。

本發(fā)明的效益是，可以通過顏色變化肉眼判定結(jié)果從而達(dá)到可視化的要求，使得本發(fā)明在實際應(yīng)用中更加簡便、快捷，并且容易操作、適用于現(xiàn)場操作。