[發(fā)明專利]一種提高中心記憶T細(xì)胞比例的T細(xì)胞制備技術(shù)

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011257242.0
• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112359016A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜舒;張蕓;紀(jì)惜鑾;劉贏瀅;謝亮;羅朝霞
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市茵冠生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;G01N15/14
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 陸豐艷

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高中心記憶T細(xì)胞比例的T細(xì)胞制備技術(shù)。本發(fā)明提供的制備技術(shù)，將HPL作為T細(xì)胞培養(yǎng)液的補充成分，主要包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離，T細(xì)胞的擴增，T細(xì)胞檢測等過程。本發(fā)明提供的制備技術(shù)，可提高中心記憶T細(xì)胞亞群的比例，而且同時達(dá)到了與FBS一致的T細(xì)胞增殖效果，且HPL更易于規(guī)模化生產(chǎn)，可滿足T細(xì)胞的臨床制備需求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高中心記憶T細(xì)胞比例的T細(xì)胞制備技術(shù)。

背景技術(shù)

近些年，作為細(xì)胞過繼免疫治療方式之一的體外修飾T細(xì)胞在一些腫瘤和自身免疫性疾病的治療中展示了良好的治療效果。嵌合抗原受體(CAR)修飾的T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)因高效靶向腫瘤抗原、殺傷能力強、可在體內(nèi)持續(xù)增殖等優(yōu)勢，在細(xì)胞治療領(lǐng)域備受矚目，目前已在血液系統(tǒng)疾病上展示了良好的臨床治療效果。盡管CAR-T細(xì)胞治療腫瘤的機制尚未研究透徹，但臨床研究結(jié)果顯示CAR-T細(xì)胞的一些生物學(xué)特征可預(yù)示臨床治療效果，初始T細(xì)胞和中心記憶T細(xì)胞(CCR7+/CD45RO+，CD62L^high)亞群在CAR-T體內(nèi)長期存活和臨床療效方面發(fā)揮著重要作用。T細(xì)胞擴增培養(yǎng)是CAR-T細(xì)胞制備的關(guān)鍵因素之一。在T細(xì)胞擴增培養(yǎng)方面，目前胎牛血清(FBS)和人AB血清常用于T細(xì)胞培養(yǎng)液的補充成分，F(xiàn)BS營養(yǎng)成分豐富，由于是動物來源，可能含有病原體而引起免疫排斥反應(yīng)，人AB血清不是動物來源，安全性較高，但是產(chǎn)量有限，因此可能無法滿足大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)需求。人血小板裂解產(chǎn)物(HPL)富含生長因子、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，可促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，有研究報道HPL用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞，但用于T細(xì)胞的培養(yǎng)仍未見相關(guān)報道。HPL含有豐富的營養(yǎng)成分，且可大規(guī)模生產(chǎn)，作為T細(xì)胞培養(yǎng)液的補充成分極具應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

為了進(jìn)一步提高中心記憶T細(xì)胞的數(shù)量，本發(fā)明創(chuàng)造性地提供了一種提高中心記憶T細(xì)胞比例的T細(xì)胞制備技術(shù)，可提高中心記憶T細(xì)胞亞群的比例，解決了FBS可能含有病原體而引起免疫排斥反應(yīng)、人AB血清產(chǎn)量有限因而可能無法滿足大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)需求的問題。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種提高中心記憶T細(xì)胞比例的T細(xì)胞制備技術(shù)，包括以下步驟：

S1、外周血單個核細(xì)胞的分離；

S2、T細(xì)胞的擴增；

S3、T細(xì)胞的檢測。

優(yōu)選地，步驟S1所述的單個核細(xì)胞分離過程為：于無菌條件下采集外周血50mL，將血液標(biāo)本送至實驗室，進(jìn)行外周血單個核細(xì)胞的分離，將血液與摩爾濃度為0.01mol/L的PBS緩沖液按1:1比例稀釋，吹打混合均勻，利用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，將細(xì)胞沉淀用含10％HPL的T細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸，制得外周血單個核細(xì)胞懸液。

優(yōu)選地，所述外周血添加抗凝劑ACD-A，外周血與ACD-A的體積比為20mL：3.5mL；所述淋巴細(xì)胞分離液可購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，貨號為LTS10771。

優(yōu)選地，所述HPL的提取方法為：將采集的外周血按20:3.5的體積比與ACD-A抗凝劑混合，按200g-400g離心力，離心10min，離心后混合物分為三層：上層為貧血小板血漿，中層為濃縮的血小板，下層為紅細(xì)胞，吸取上層、中層懸液，轉(zhuǎn)移至新的離心管，于200g-400g下離心10min，離心后混合物分為三層：上層為貧血小板血漿，中層為高度濃縮的血小板，下層為紅細(xì)胞，收集中層高度濃縮的血小板，置于-80℃冰箱中24h后取出，置于37℃水浴鍋中直至融化，再次重復(fù)上述凍融操作，以充分裂解血小板，將上述裂解后的血小板于4℃，4000rpm下，離心15min，吸取上層血小板裂解產(chǎn)物，用0.22μm過濾器過濾后分裝，于-20℃保存。