[發明專利]一種提高中心記憶T細胞比例的T細胞制備技術

在審

• 申請號: 202011257242.0
• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112359016A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 姜舒;張蕓;紀惜鑾;劉贏瀅;謝亮;羅朝霞
• 申請（專利權）人: 深圳市茵冠生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;G01N15/14
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 陸豐艷

1.一種提高中心記憶T細胞比例的T細胞制備技術，其特征在于，包括以下步驟：

S1、外周血單個核細胞的分離；

S2、T細胞的擴增；

S3、T細胞的檢測。

2.如權利要求1所述的T細胞制備技術，其特征在于，步驟S1所述的單個核細胞分離過程為：于無菌條件下采集外周血50mL，將血液標本送至實驗室，進行外周血單個核細胞的分離，將血液與摩爾濃度為0.01mol/L的PBS緩沖液按1:1比例稀釋，吹打混合均勻，利用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，將細胞沉淀用含10％HPL的T細胞無血清培養基重懸，制得外周血單個核細胞懸液。

3.如權利要求2所述的T細胞制備技術，其特征在于，所述外周血添加抗凝劑ACD-A，外周血與ACD-A的體積比為20ml：3.5mL；所述淋巴細胞分離液可購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，貨號為LTS10771。

4.如權利要求2所述的T細胞制備技術，其特征在于，所述HPL的提取方法為：將采集的外周血按20:3.5的體積比與ACD-A抗凝劑混合，按200g-400g離心力，離心10min，離心后混合物分為三層：上層為貧血小板血漿，中層為濃縮的血小板，下層為紅細胞，吸取上層、中層懸液，轉移至新的離心管，于200g-400g下離心10min，離心后混合物分為三層：上層為貧血小板血漿，中層為高度濃縮的血小板，下層為紅細胞，收集中層高度濃縮的血小板，置于-80℃冰箱中24h后取出，置于37℃水浴鍋中直至融化，再次重復上述凍融操作，以充分裂解血小板，將上述裂解后的血小板于4℃，4000rpm下，離心15min，吸取上層血小板裂解產物，用0.22μm過濾器過濾后分裝，于-20℃保存。

5.如權利要求2所述的T細胞制備技術，其特征在于，所述T細胞無血清培養基可購自TAKARA生物公司，貨號為SK551S。

6.如權利要求1所述的T細胞制備技術，其特征在于，步驟S2所述的擴增過程為：向制得的外周血單個核細胞懸液中，添加CD3/CD28抗體偶聯磁珠激活T細胞，在上述培養體系中添加重組人IL-2使其終濃度為300IU/mL-500IU/mL，同時添加重組人IL-7與重組人IL-15使其終濃度均為5ng/mL-8ng/mL，將細胞置于培養箱中培養。

7.如權利要求6所述的T細胞制備技術，其特征在于，所述CD3/CD28抗體偶聯磁珠與外周血單個核細胞的比例為1：1-3：1。

8.如權利要求6所述的T細胞制備技術，其特征在于，所述培養箱中的培養條件為37℃、5％的CO₂濃度，培養時間為14天，根據細胞生長增殖情況補充培養液。

9.如權利要求1所述的T細胞制備技術，其特征在于，步驟S3所述的檢測過程為：將T細胞懸液收集后，于1000rpm下離心10min，去上清，細胞沉淀用4℃預冷的0.01mol/L的PBS緩沖液洗滌2次，每次以1000rpm離心10min，用200μL PBS緩沖液重懸細胞沉淀，取1×10⁶個細胞用0.1mL預冷的0.01mol/L PBS重懸，避光加入相應熒光抗體，4℃避光孵育30min，加入2mL PBS，l000rpm離心l0min，洗滌細胞以除去未結合的抗體，去上清，細胞沉淀用PBS液重懸，上流式細胞儀檢測。

10.如權利要求9所述的T細胞制備技術，其特征在于，所述熒光抗體包括CD4Antibody-FITC，CD8 Antibody-PE，CD197(CCR7)Antibody-PerCP，CD45RO Antibody-APC，CD3 Antibody-APC，CD62L Antibody-FITC，CD56 Antibody-PerCP。