[發明專利]一種靶向敲除斑點叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列及其篩選方法

在審

• 申請號: 202011255641.3
• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112342215A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 張世勇;陳校輝;王明華;鐘立強;徐思琪;段永強;邊文冀
• 申請（專利權）人: 江蘇省淡水水產研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/89;C12N15/55;C12N15/11
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 徐激波

1.一種靶向敲除斑點叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列的篩選方法，其特征在于：包括，

設計CRISPR序列，所述CRISPR序列如序列SEQ NO.1～SEQ NO.8所示；

用所述CRISPR序列制備含目標基因片段的PCR擴增產物，制備目標基因的PCR擴增產物，所述目標基因片段如序列SEQ NO.9所示；

將所述含目標基因片段的PCR擴增產物與載體連接、轉化后篩選陽性轉化子，經克隆搖菌并抽提出包含目的基因的質粒；

根據設計的CRISPR序列，用體外轉錄方法制備sgRNA；

將所述sgRNA、所述包含目的基因的質粒和Cas9蛋白顯微注射斑馬魚受精卵，以斑馬魚受精卵作為反應器篩選編輯斑點叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列。

2.如權利要求1所述的靶向敲除斑點叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列的篩選方法，其特征在于：所述sgRNA，其序列包括SEQ NO.21～SEQ NO.28中所示的一種或幾種。

3.如權利要求1所述的靶向敲除斑點叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列的篩選方法，其特征在于：所述用體外轉錄方法制備sgRNA，其使用的正向引物序列包括序列SEQ NO.12～SEQNO.19中所示的一種或幾種。

4.如權利要求1～3任一項所述的靶向敲除斑點叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列的篩選方法，其特征在于：所述經克隆搖菌并抽提出包含目的基因的質粒，其使用的引物序列包括序列SEQ NO.10、SEQ NO.11中所示的一種或幾種。

5.如權利要求1～3任一項所述的靶向敲除斑點叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列的篩選方法，其特征在于：所述顯微注射，其使用的所述sgRNA在注射液中的終濃度為100ng/μL，Cas9蛋白的終濃度為250ng/μL。

6.用于靶向敲除斑點叉尾鮰mstna基因的序列，其特征在于：包括，

CRISPR序列，包括序列SEQ NO.4、SEQ NO.8中所示的一種或幾種；

引物，包括序列SEQ NO.10～SEQ NO.20中所示的一種或幾種；以及，

sgRNA序列，包括序列SEQ NO.21～SEQ NO.28中所示的一種或幾種。