[發(fā)明專利]一種靶向敲除斑點(diǎn)叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列及其篩選方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011255641.3
• 申請(qǐng)日: 2020-11-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112342215A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張世勇;陳校輝;王明華;鐘立強(qiáng);徐思琪;段永強(qiáng);邊文冀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/85;C12N15/89;C12N15/55;C12N15/11
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249
• 代理人: 徐激波

本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向敲除斑點(diǎn)叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列及其篩選方法，通過(guò)設(shè)計(jì)CRISPR序列，制備包含目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并將其與載體連接，再通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄方法制備sgRNA，將所述sgRNA、所述包含目的基因的質(zhì)粒和Cas9蛋白顯微注射斑馬魚(yú)受精卵，以斑馬魚(yú)受精卵作為反應(yīng)器篩選靶向敲除斑點(diǎn)叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列。本發(fā)明首次以斑馬魚(yú)受精卵作為反應(yīng)器篩選出編輯斑點(diǎn)叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列，特異性強(qiáng)且敲除效率高，敲除流程簡(jiǎn)單快捷，為后續(xù)解析斑點(diǎn)叉尾鮰mstna基因功能提供動(dòng)物材料。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于斑點(diǎn)叉尾鮰基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)計(jì)一種靶向敲除斑點(diǎn)叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列及其篩選方法。

背景技術(shù)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的獲得性免疫防御系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)菌遭受病毒的侵染時(shí)，會(huì)在自身基因組里留下外源基因片段作為“記憶抗體”以識(shí)別再次侵入的病毒。CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)元件和編碼一系列Cas蛋白的基因組成，其中CRISPR元件由多個(gè)相同的重復(fù)序列(repeat)與不同的間隔序列(spacer)交替排列組成。CRISPR/Cas9是CRISPR/Cas系統(tǒng)中應(yīng)用最為廣泛的一種類型，Cas蛋白由單一的Cas9蛋白構(gòu)成，Cas9蛋白主要功能的發(fā)揮依賴于：(1)Cas9在細(xì)菌內(nèi)需要crRNA和反式激活RNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)共同引導(dǎo)其靶向目標(biāo)序列，現(xiàn)基因工程中已將兩個(gè)RNA分子進(jìn)行適當(dāng)改造，序列整合為一條單鏈引導(dǎo)RNA(single guide RNA,sgRNA)；(2)Cas9特異性識(shí)別靶向DNA3’端的3～7bp的堿基對(duì)，即PAM(protospacer adjacent motif)區(qū)。現(xiàn)由于gRNA設(shè)計(jì)合成方便，且此系統(tǒng)對(duì)靶基因敲除效率的高效性，使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞與動(dòng)物模型的遺傳學(xué)改造。

肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin,MSTN)又稱生長(zhǎng)/分化因子8(growth anddifferentiation factor,GDF8)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor,TGF-β)超家族成員，是脊椎動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子。McPherron等(1997)首次報(bào)道了小鼠mstn基因的缺失產(chǎn)生了典型的超肌表型。mstn基因的突變導(dǎo)致雙肌表型這一現(xiàn)象在牛和綿羊等物種中均有報(bào)道。以mstn基因?yàn)榘形稽c(diǎn)的基因編輯動(dòng)物模型具有更多的肌細(xì)胞和更快的生長(zhǎng)速度，較多基于ZFNs、TALEN或CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。此外，阻斷mstn基因激活信號(hào)通路被認(rèn)為是提高肌肉產(chǎn)量的另外一種策略。許多MSTN蛋白結(jié)合抗體或抑制肽也被認(rèn)為具有阻斷成熟肌肉生長(zhǎng)抑制素信號(hào)通路以增加肌肉產(chǎn)量的功能。如何利用CRISPR/Cas9對(duì)斑點(diǎn)斑點(diǎn)叉尾鮰mstna基因進(jìn)行有效編輯是需要解決的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種靶向敲除斑點(diǎn)叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列及其篩選方法。

技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案：一種靶向敲除斑點(diǎn)叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列的篩選方法，其包括，設(shè)計(jì)CRISPR序列，所述CRISPR序列如序列SEQNO.1～SEQ NO.8所示；用所述CRISPR序列制備含目標(biāo)基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，制備目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述目標(biāo)基因片段如序列SEQ NO.9所示；將所述含目標(biāo)基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接、轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)克隆搖菌并抽提出包含目的基因的質(zhì)粒；根據(jù)設(shè)計(jì)的CRISPR序列，用體外轉(zhuǎn)錄方法制備sgRNA；將所述sgRNA、所述包含目的基因的質(zhì)粒和Cas9蛋白顯微注射斑馬魚(yú)受精卵，以斑馬魚(yú)受精卵作為反應(yīng)器篩選編輯斑點(diǎn)叉尾鮰mstna基因的sgRNA序列。

優(yōu)選的，所述sgRNA，其序列包括SEQ NO.21～SEQ NO.28中所示的一種或幾種。