[發明專利]一種測定甘蔗體內固氮菌固氮酶活性的方法

在審

• 申請號: 202011254175.7
• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112342267A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 李長寧;農倩;林麗;謝金蘭;莫璋紅
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12Q1/02
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 江舟

本發明公開了一種測定甘蔗體內固氮菌固氮酶活性的方法，包括取樣與樣品處理、培養、取其葉片和蔗莖消毒、滅菌、加入液體培養基，注入乙炔氣體、封口、再挑選單菌落繼續培養，測定其固氮酶活性。本發明通過將測定的甘蔗體樣品進行取樣與樣品處理、培養、取其葉片和蔗莖消毒、滅菌、加入液體培養基，注入乙炔氣體、封口、再挑選單菌落繼續培養，測定其固氮酶活性，用于測定甘蔗體內的固氮菌固氮酶活性的液體/NFb培養基組成簡單、易于配制、成本低，且液體/NFb培養基對甘蔗體內固氮菌的選擇性較小，通過不施氮肥和消毒使得試驗結果更加準確，防止試驗結果差異大，且乙炔的注入量，方便對固氮菌固氮酶活性的檢測。

技術領域

本發明涉及測定固氮菌固氮酶活性領域，特別涉及一種測定甘蔗體內固氮菌固氮酶活性的方法。

背景技術

甘蔗是熱帶和亞熱帶地區的重要經濟作物之一，甘蔗生物固氮及其應用研究對于甘蔗生產中節約氮肥成本、減少環境污染具有非常重要的意義。在巴西，有些地方連續種蔗50年以上，有的甚至超過100年，在低氮投人(新植蔗60kgN/肼、宿根120kg N/hm2以下)及每造收獲時幾乎全部植株氮素被帶走(每造甘蔗100～200kg N/hm3)的情況下土壤的氮儲量并不下降。上世紀50年代到70年代,許多種有固氮能力的細菌在甘蔗體內被發現,到80年代,科學家們用N平衡法研究證實巴西的一些甘蔗品種能從空氣中獲得相當多的氮素、

固氮酶活性測定是鑒別固氮微生物固氮能力或固氮效能大小的指標。甘蔗生物固氮能力測定常用的有乙炔還原法、氮平衡法、N同位素稀釋法、N同位素自然豐度法等。其中乙炔還原法測定固氮酶活性為常用的方法，它具有靈敏度高、且方法簡單、速度快等特點，甘蔗生物固氮為聯合固氮，植株高大，進入伸長期其固氮能力才能充分。

本發明提供一種測定甘蔗體內固氮菌固氮酶活性的方法，具體包括如下步驟：

a.取樣與樣品處理：取6-10份葉的蔗莖帶回室內，自來水沖洗，蒸餾水沖洗，無菌水沖洗、無菌紙除水，去蔗皮，取6份葉蔗莖中部切碎細小均勻，稱取樣品2g，轉入100ml培養瓶中，加培養基至總體積為10ml，用膠塞密封好；

b..將培養后的樣品分開進行桶栽，桶內土壤pH 6.0，有機質1.6％，全N含量0.13％.速效N含量55mg/kg，速效P含量24nag/kg，速效K含量188mg/kg，桶內溫度為30℃，進行培養；

c.不施氮肥，在宿根伸長期取其葉片和蔗莖，清水洗干凈，在超凈工作臺上先以70％酒精表面消毒，再用0.1％升汞消毒5rain；

d.滅菌水沖洗4次以后.在滅菌過的研缽中磨碎.轉人60mL磨口的白小口瓶中，加入液體/NFb培養基，分別依次注入2％、4％、6％和8％的乙炔氣體，封口，30℃，120r/mln搖床培養.3d后提取上清液轉入新的培養基繼續培養，共轉接培養4次后，在JNFb固體培養基平板上劃線培養；

e.再挑選單菌落繼續培養，測定其固氮酶活性；

f.取100uL反應氣體在氣象相色譜儀中測定乙烯生成量,根據以下公式換算成固氮酶活性，固氮酶活性(nmol/mg*h)＝CH4摩爾數(nmol)/(菌體蛋白量(mg)×反應時間(h))，CH4 nmol＝CH4體積(uL)×273×P/[22.4x(273+t℃)×760]。

作為本發明的一種優選技術方案，所述步驟a-f所有操作均在無菌狀態下完成。

與現有技術相比，本發明的有益效果如下：

1：本發明通過將測定的甘蔗體樣品進行取樣與樣品處理、培養、取其葉片和蔗莖消毒、滅菌、加入液體培養基，注入乙炔氣體、封口、再挑選單菌落繼續培養，測定其固氮酶活性，用于測定甘蔗體內的固氮菌固氮酶活性的液體/NFb培養基組成簡單、易于配制、成本低，且液體/NFb培養基對甘蔗體內固氮菌的選擇性較小，通過不施氮肥和消毒使得試驗結果更加準確，防止試驗結果差異大，且乙炔的注入量，方便對固氮菌固氮酶活性的檢測。