[發(fā)明專利]一種測定甘蔗體內(nèi)固氮菌固氮酶活性的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011254175.7
• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112342267A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李長寧;農(nóng)倩;林麗;謝金蘭;莫璋紅
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12Q1/02
• 代理公司: 北京同輝知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11357
• 代理人: 江舟

1.一種測定甘蔗體內(nèi)固氮菌固氮酶活性的方法，其特征在于，所述具體包括如下步驟：

a.取樣與樣品處理：取6-10份葉的蔗莖帶回室內(nèi)，自來水沖洗，蒸餾水沖洗，無菌水沖洗、無菌紙除水，去蔗皮，取6份葉蔗莖中部切碎細(xì)小均勻，稱取樣品2g，轉(zhuǎn)入100ml培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)基至總體積為10ml，用膠塞密封好；

b..將培養(yǎng)后的樣品分開進(jìn)行桶栽，桶內(nèi)土壤pH 6.0，有機質(zhì)1.6％，全N含量0.13％.速效N含量55mg/kg，速效P含量24nag/kg，速效K含量188mg/kg，桶內(nèi)溫度為30℃，進(jìn)行培養(yǎng)；

c.不施氮肥，在宿根伸長期取其葉片和蔗莖，清水洗干凈，在超凈工作臺上先以70％酒精表面消毒，再用0.1％升汞消毒5rain；

d.滅菌水沖洗4次以后.在滅菌過的研缽中磨碎.轉(zhuǎn)人60mL磨口的白小口瓶中，加入液體/NFb培養(yǎng)基，分別依次注入2％、4％、6％和8％的乙炔氣體，封口，30℃，120r/mln搖床培養(yǎng).3d后提取上清液轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，共轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4次后，在JNFb固體培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)；

e.再挑選單菌落繼續(xù)培養(yǎng)，測定其固氮酶活性；

f.取100uL反應(yīng)氣體在氣象相色譜儀中測定乙烯生成量,根據(jù)以下公式換算成固氮酶活性，固氮酶活性(nmol/mg*h)＝CH4摩爾數(shù)(nmol)/(菌體蛋白量(mg)×反應(yīng)時間(h))，CH4nmol＝CH4體積(uL)×273×P/[22.4x(273+t℃)×760]。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定甘蔗體內(nèi)固氮菌固氮酶活性的方法，其特征在于，所述步驟a-f所有操作均在無菌狀態(tài)下完成。