[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于鎖式探針技術(shù)生成單鏈環(huán)狀DNA的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011252396.0
• 申請(qǐng)日: 2020-11-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112359083B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-01-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 齊浩;郜艷敏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10;C12P19/34;C12Q1/6827
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 劉猛

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開(kāi)了一種基于鎖式探針技術(shù)生成單鏈環(huán)狀DNA的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明所述方法針對(duì)單鏈靶基因設(shè)計(jì)鎖式探針以及blocker探針，然后使用DNA連接酶進(jìn)行連接，連接后加入外切酶去除未連接的鎖式探針，獲得單鏈環(huán)狀DNA。本發(fā)明利用Blocker探針介導(dǎo)的鎖式探針技術(shù)生成環(huán)狀DNA(cssDNA)及用于檢測(cè)單位點(diǎn)變異，本發(fā)明提供的方法可以提高cssDNA的產(chǎn)量，減少多聚物的生成，同時(shí)該方法可以進(jìn)行高特異性高靈敏度的核酸檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是涉及一種基于鎖式探針技術(shù)生成單鏈環(huán)狀DNA的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

鎖式探針技術(shù)是指帶有5’-PO₄基團(tuán)的ssDNA(single-stranded DNA)以首尾相連的方式特異性地結(jié)合到與其互補(bǔ)的靶基因序列上，在連接酶的作用下成環(huán)。該技術(shù)可應(yīng)用于環(huán)狀單鏈DNA(circular single-stranded DNA,cssDNA)的生產(chǎn)。另外，鎖式探針結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)可應(yīng)用于分子生物學(xué)及醫(yī)療領(lǐng)域，如植物病毒分型檢測(cè)、病原菌檢測(cè)、SNP檢測(cè)及癌癥突變基因檢測(cè)等。

單鏈環(huán)狀DNA(cssDNA,15-200nt)對(duì)分子生物學(xué)、醫(yī)藥領(lǐng)域以及生物技術(shù)等方面都是具有重要的研究及應(yīng)用價(jià)值的。因其相比線性單鏈DNA而言，其具有抗核酸外切酶的活性，使得cssDNA更穩(wěn)定。該優(yōu)勢(shì)吸引了眾多科學(xué)家的關(guān)注。Bio-Synthesis公司開(kāi)展了一項(xiàng)合成單鏈cssDNA的業(yè)務(wù)，以應(yīng)用于疾病診斷、RCA反應(yīng)、miRNA傳送載體以及突變的檢測(cè)。

目前，cssDNA的合成主要有化學(xué)合成和酶促合成兩種方法?；瘜W(xué)合成：溴化氰是化學(xué)合成cssDNA過(guò)程中不可或缺的試劑，但其具有劇毒，對(duì)環(huán)境和人身健康都有重大的威脅；另外該方法合成周期較長(zhǎng)。酶促催化合成：沒(méi)有化學(xué)試劑的使用，所以不會(huì)對(duì)環(huán)境及人身健康造成危害；同時(shí)可以得到較高的產(chǎn)率。但其成本較高，而且有一定的副產(chǎn)物-多聚物(polymer)的生成。

同時(shí)，基于核酸檢測(cè)的分子診斷技術(shù)正在越來(lái)越廣泛地用于臨床，為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷及治療提供信息和決策依據(jù)。人體體液中循環(huán)的片段化的DNA(Circulatingcell-free DNA,cfDNA)作為非侵入性篩查和診斷的遺傳物質(zhì)得到眾多科學(xué)家及臨床醫(yī)生的關(guān)注。Fernando M R和其同事發(fā)現(xiàn)在血漿中包含76bp，135bp，490bp和905bp的DNA分別占比100％、39％、18％、5.6％，說(shuō)明這些游離的DNA是高度片段化的。但高度片段的DNA對(duì)于目前已有的核酸檢測(cè)技術(shù)具有很大的挑戰(zhàn)性。

PCR技術(shù)尤其是熒光定量PCR(qPCR)是應(yīng)用最為廣泛的核酸檢測(cè)技術(shù)之一。但由于PCR技術(shù)：1)需要精準(zhǔn)的溫控系統(tǒng)；2)qPCR技術(shù)需要昂貴的熒光染料或熒光探針，這也相對(duì)地增加了成本；3)對(duì)引物及探針的設(shè)計(jì)也極為嚴(yán)格；4)PCR技術(shù)尤其熒光定量PCR技術(shù)在核酸檢測(cè)擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度在150bp-250bp左右，且對(duì)引物的設(shè)計(jì)需要靶標(biāo)序列已知，而cfDNA高度片段化，且基因組在片段化的位置不確定，所以對(duì)于cfDNA而言，其長(zhǎng)度和序列均是未知，這對(duì)于設(shè)計(jì)PCR引物與探針具有很大的挑戰(zhàn)性，造成較高的假陽(yáng)性或假陰性。這些不利因素導(dǎo)致PCR技術(shù)在偏遠(yuǎn)地區(qū)及貧困地區(qū)受到了一定的限制。因此，開(kāi)發(fā)靈敏度高、特異性好的恒溫檢測(cè)技術(shù)具有非常重大的意義。