[發明專利]用于細菌表達DacA時提高c-di-AMP產量的多核苷酸

有效

• 申請號: 202011247820.2
• 申請日: 2020-11-10
• 公開（公告）號: CN112342233B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發明（設計）人: 蔣宇
• 申請（專利權）人: 上海陶宇晟生物技術有限責任公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/65;C12N15/60;C12N1/21;C12P19/32;C12P19/36;C12R1/19
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發明公開了一種用于細菌表達DacA時提高c?di?AMP產量的多核苷酸，其組成為：Ptet?可變翻譯起始區?dacA，其中Ptet是啟動子；可變翻譯起始區是ATG前17個堿基至ATG之后6個堿基的序列；dacA是編碼二腺苷酸環化酶DacA的基因?？寺×嗽摱嗪塑账岬闹亟M菌株能夠高產c?di?AMP。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地說，涉及一種用于細菌表達二腺苷酸環化酶A(DacA)時提高c-di-AMP產量的多核苷酸。

背景技術

2008年，Witte等在解析枯草芽胞桿菌DNA完整性掃描蛋白A(DNA integrityscanning protein A，DisA)晶體結構時發現了環二腺苷酸(Cyclic diadenosinemonophosphate，c-di-AMP，簡寫CDA)分子，因此將DisA命名為二腺苷酸環化酶(Diadenylate cyclase，DAC)，并將其具有催化活性的結構域命名為Dac結構域。c-di-AMP是由兩分子ATP經二腺苷酸環化酶A(Diadenylate cyclase A，DacA)催化合成的環狀核苷酸分子。

環二腺苷酸(c-di-AMP，簡寫CDA)是細菌中廣泛存在的第二信號分子。c-di-AMP在細菌中的代謝受二腺苷酸環化酶A(DacA)和磷酸二酯酶(PDE)的精密調控。c-di-AMP不僅調節細菌生長、細胞壁穩態、離子轉運多種生理過程，而且能夠被真核宿主胞內多種感應子/受體蛋白識別，從而調控抗感染免疫。細菌c-di-AMP參與調控宿主I型干擾素應答、NF-κB信號通路活性、自噬以及炎癥小體應答等固有免疫應答。此外，c-di-AMP作為黏膜佐劑可誘導宿主適應性免疫。c-di-AMP被認為是一種新發現的病原體相關的分子模式(PAMP)，已成為細菌疫苗和藥物研究中的新靶點。

由于細菌的c-di-AMP參與細胞凋亡等生理活動，因此利用工程細菌產c-di-AMP時需要精確調至合適的劑量。

大腸桿菌屬Nissle 1917(EcN)是一種非致病性大腸桿菌，是1917年從一次志賀菌痢大爆發時未出現腹瀉的士兵的糞便中分離得到的。EcN是非乳酸益生菌中研究最多的益生菌，血清型為O6：K5：H1，具有獨特的基因組、半粗糙O6-脂多糖(LPS)表型、K5型莢膜、3種不同的菌毛(F1A、F1C和卷曲菌毛)。EcN具有小菌素和鐵攝取系統等特殊適應性因子，在與其他微生物競爭中起關鍵作用。EcN能長期穩定定植于腸道，與腸上皮細胞相互作用，被廣泛用于預防傳染性腹瀉、炎性腸疾病如潰瘍性結腸炎和克羅恩病，防止新生兒消化道內病原菌定殖等，和發揮免疫調節生物學功能。

發明內容

我們已經對大腸桿菌屬Nissle 1917(EcN)進行了長期的研究，并構建了一系列具有應用前景的菌株，包括TYS001菌株，參見文獻(Immunotherapy with engineeredbacteria by targeting the STING pathway for anti-tumor immunity.DanielS.Leventhal，Anna Sokolovska，Ning Li，Christopher Plescia，Jose M.Lora.NATURECOMMUNICATIONS.2020,11:2739.DOI：10.1038/s41467-020-16602-0.。

在利用大腸桿菌Nissle 1917(EcN)表達DacA時，c-di-AMP是表達dacA基因后的代謝產物。為了提高c-di-AMP的產量，我們對于dacA基因表達盒的結構進行了大量的探索和優化。因此，本發明的目的在于提供一種用于細菌表達DacA時提高c-di-AMP產量的多核苷酸，其組成為：Ptet-可變翻譯起始區-dacA，其中

Ptet是啟動子；可變翻譯起始區是ATG前17個堿基至ATG之后6個堿基的序列；dacA是編碼二腺苷酸環化酶A(Diadenylate cyclase A，DacA)的基因。