[發(fā)明專利]鴿毛滴蟲與白色念珠菌二聯(lián)卵黃抗體粉的制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011246428.6
• 申請(qǐng)日: 2020-11-10
• 公開（公告）號(hào): CN112358545B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何誠;王飛;張禾;蔡淯涵;黃中佐;嚴(yán)沛潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/20
• 分類號(hào): C07K16/20;C07K16/14;C07K16/02;A61K39/395;A61P33/02;A61P31/10;A61P1/02
• 代理公司: 北京智為時(shí)代知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

1.一種鴿毛滴蟲與白色念珠菌二聯(lián)卵黃抗體粉的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟：

S1、獲得鴿毛滴蟲和白色念珠菌菌液；

S2、將鴿毛滴蟲滅活獲得鴿毛滴蟲抗原，將白色念珠菌滅活獲得滅活白色念珠菌抗原；

S3、將上述2種滅活抗原與β-1，3/1，6葡聚糖、賽彼科的763A佐劑制備二聯(lián)滅活疫苗，免疫產(chǎn)蛋母雞；

S4、收集免疫后雞蛋，分離卵黃，以泊洛沙姆188除去蛋黃中脂肪成分，然后濾液經(jīng)過中空纖維膜濃縮，獲得濃縮抗體，加入麥芽糊精干燥獲得鴿毛滴蟲與白色念珠菌二聯(lián)卵黃抗體粉。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟S1中，所述鴿毛滴蟲采用蛋白胨、牛肝浸粉、磷酸氫二鉀、5%~10%孕馬血清制備的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素、兩性霉素后大量擴(kuò)增鴿毛滴蟲；

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基按照蛋白胨10g、牛肝浸粉10g、磷酸氫二鉀1g和1000ml雙蒸水的比例配置，高壓滅菌后，添加體積比為5%~10%的孕馬血清；按青霉素1000U/mL、鏈霉素1000U/mL、兩性霉素B10μg/mL加入，擴(kuò)增的條件為在37℃培養(yǎng)48~60小時(shí)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟S2中，所述鴿毛滴蟲滅活為超聲波破碎滅活，白色念珠菌滅活為加熱滅活和超聲破碎相結(jié)合的方式。

4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟S2中，所述鴿毛滴蟲滅活的方法為將鴿毛滴蟲培養(yǎng)液于6000rpm離心5min，然后棄上清取沉淀用生理鹽水洗滌2~4次，每次6000rpm離心5min，收集沉淀，進(jìn)行超聲波破碎，工作5s，暫停8s，功率400W， 40個(gè)循環(huán)，然后靜置于冰上10min，再以相同方式進(jìn)行超聲波破碎，超聲累積工作80個(gè)循環(huán)，破碎完畢后6000rpm離心5min，收集上清，檢驗(yàn)滅活，獲得鴿毛滴蟲滅活抗原；

所述白色念珠菌滅活的方法為收集菌體沉淀在70℃加熱2h，之后進(jìn)行超聲波破碎，工作5s，暫停8s，間隔破碎，功率400W ，50個(gè)循環(huán)，然后靜置于冰上10min，再以相同方式進(jìn)行超聲波破碎，超聲累積工作100個(gè)循環(huán)； 3000rpm離心5min收集上清，檢驗(yàn)滅活，獲得鴿白色念珠菌滅活抗原。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟S3中，將抗原添加到體積比為0.2%的β-1，3/1，6葡聚糖中，然后與賽彼科763A疫苗佐劑按3:7的體積比混合，然后使用磁力攪拌器進(jìn)行乳化獲得二聯(lián)滅活疫苗，每羽份二聯(lián)滅活疫苗0.5mL含有鴿毛滴蟲1×10⁶CFU，白色念珠菌1×10⁸CFU。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟S3中，產(chǎn)蛋母雞為180日齡的健康蛋雞，進(jìn)行頸部皮下免疫，每只雞免疫注射0.5mL，每次免疫后間隔10天進(jìn)行免疫，共免疫三次，第三次免疫后14天收集雞蛋，用于步驟S4。

7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟S4中，按卵黃與泊洛沙姆188體積比為1:8比例加入1.0％泊洛沙姆，調(diào)整pH值在7.2，于4-8 ℃靜置24 h，除去脂肪，獲得卵黃抗體溶液后，中空纖維超濾膜濃縮純化，將卵黃抗體溶液經(jīng)孔徑為截流分子量為30kD的中空纖維超濾膜進(jìn)行純化濃縮。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟S4中，所述濃縮抗體與麥芽糊精按1：1~1：1.5的比例混合進(jìn)行干燥，干燥采用低溫真空干燥機(jī)，烘干方式為連續(xù)加料，連續(xù)出料，進(jìn)口溫度為70℃，出口溫度設(shè)定為30~40℃，干燥3~5小時(shí)。

9.由權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述制備方法制備得到的鴿毛滴蟲與白色念珠菌二聯(lián)卵黃抗體粉。

10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述制備方法獲得的鴿毛滴蟲與白色念珠菌二聯(lián)卵黃抗體粉在制備防治信鴿、肉鴿和珍珠雞口腔中毛滴蟲、白色念珠菌感染引起的口腔、嗉囊潰瘍的飼料中的應(yīng)用。