[發明專利]CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡及其制備和使用方法

在審

• 申請號: 202011246354.6
• 申請日: 2020-11-10
• 公開（公告）號: CN112485437A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 劉雨晴;周興智;佟曄;魏計東;閻紅;葛祥武
• 申請（專利權）人: 基因賽奧（大連）生物科技發展有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/573;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 沈陽天贏專利代理有限公司 21251
• 代理人: 李榮新

本發明公開了CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡及其制備和使用方法，屬于轉基因蛋白試紙領域。CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡，所述測試紙卡包括卡殼1和試紙條2，所述試紙條2主體為底板3，所述底板3上依次設置粘貼樣品墊4、金標墊5、硝酸纖維素膜6和吸水紙7，所述硝酸纖維素膜6上設置T1線6?2、T2線6?3和C線6?1。本發明的CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡可針對轉基因農作物的葉片、種子及其初級加工產品等樣品中轉基因蛋白CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac的快速、現場和靈敏的檢測。

技術領域

本發明涉及CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡及其制備和使用方法，屬于轉基因蛋白試紙領域。

背景技術

轉基因技術的原理是將人工分離和修飾過的優質基因，導入到生物體基因組中，從而達到改造生物的目的。即將基因片段轉入特定生物中，與其本身的基因組進行重組，再從重組體中進行數代的人工選育，從而獲得具有穩定表現的遺傳性狀個體，該技術可以使重組生物增加人們所期望的新性狀，培育出新品種。

EPSP合成酶(5-enolpyruvyl l-shikimate-3-phosphates thase,EPSPS)是廣泛存在于微生物和高等植物中重要酶類，是生物體內芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成過程中的關鍵性酶，能為植物生長所需的芳香族氨基酸的合成提供前提物質。草甘磷能通過抑制EPSPS的活性而阻斷芳香族氨基酸的合成最終導致受試植物死亡。但是來自根癌農桿菌CP4的EPSPS的活性不被草甘膦所抑制，該細菌EPSPS基因的表達可以使植物免受除草劑的傷害，使得CP4 EPSPS基因被廣泛用于多種轉基因作物中，如玉米、大豆等以提高作物生產中的田間除草效果，降低生產成本。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽性菌，在芽抱形成時能產生一種具有特異性殺蟲活性的殺蟲晶體蛋白(lnsecticidalcrystal protein，ICPs)，該蛋白能特異性的殺死鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、同翅目等昆蟲，以及動植物線蟲、蜱螨等節肢動物。ICP常以內毒素形式存在，當昆蟲攝食ICP后，在昆蟲消化道中腸消化酶的作用下，內毒素被降解成有毒的多肽，多肽分子與昆蟲中腸上皮細胞上的特異受體結合，致使細胞膜產生穿孔，引起細胞腫脹裂解，使昆蟲幼蟲停止取食，最終導致死亡。Bt殺蟲蛋白基因現已被廣泛應用在植物基因工程及轉基因育種中。Cry殺蟲蛋白是Bt蛋白的一種，對鱗翅目等多種害蟲具有較好毒殺作用，Cry1Ab/Ac基因已被應用于抗蟲棉花、玉米等轉基因作物。

免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、檸檬三鈉等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可通過靜電結合與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合。膠體金標記技術是免疫層析快速診斷的核心技術，它以膠體金作為示蹤標記物應用于抗原抗體反應。根據膠體金的高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應等特性，加上結合物的免疫和生物學特性，使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。

日前轉基因蛋白的常規檢測方法是PCR和Elisa檢測，但是該類方法對場地、儀器、技術人員的要求比較高，樣本處理復雜，不適合大量的篩選檢測及田間快檢。有部分轉基因蛋白已經可以通過速測試紙進行檢測，但是一次只能檢測一種轉基因蛋白，對于同時檢測雙轉基因蛋白的方法和產品，目前仍為市場空白。

發明內容

為解決現有技術中轉基因蛋白的檢測方法對場地、儀器、技術人員的要求較高，樣本處理復雜，不適合大量篩選檢測及田間快檢，且一次只能檢測一種轉基因蛋白的問題，本發明提供CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡及其制備方法和應用，具體技術方案如下：