[發明專利]CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡及其制備和使用方法

在審

• 申請號: 202011246354.6
• 申請日: 2020-11-10
• 公開（公告）號: CN112485437A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 劉雨晴;周興智;佟曄;魏計東;閻紅;葛祥武
• 申請（專利權）人: 基因賽奧（大連）生物科技發展有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/573;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 沈陽天贏專利代理有限公司 21251
• 代理人: 李榮新

1.CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡，其特征在于：所述測試紙卡包括卡殼(1)和試紙條(2)，所述試紙條(2)主體為底板(3)，所述底板(3)上依次設置樣品墊(4)、金標墊(5)、硝酸纖維素膜(6)和吸水紙(7)，所述硝酸纖維素膜(6)上設置T1線(6-2)、T2線(6-3)和C線(6-1)。

2.根據權利要求1所述的CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡，其特征在于：所述金標墊(5)上固定有膠體金標記的特異性單克隆抗體。

3.根據權利要求1所述的CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡，其特征在于：所述T1線(6-2)處固定有1-2mg/ml鼠抗CP4 EPSPS單克隆抗體，所述T2線(6-3)處固定有1-2mg/ml鼠抗Bt Cry1Ab/Ac單克隆抗體；C線(6-1)處固定有0.5-1mg/ml的羊抗鼠IgG二抗。

4.CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測試紙卡的制備方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

(1)制備40nm膠體金

①將500ml燒杯、20ml小燒杯、轉子、棕色瓶、玻璃棒等洗凈后放入酸缸中浸泡24小時，取出先用自來水沖洗3-4次，再用超純水沖洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干備用；

②用塑料稱量匙稱取0.5-2g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入100ml超純水溶解，4℃避光保存；稱取0.1g檸檬酸三鈉溶解于10ml超純水中，混合均勻備用；

③量取100ml超純水于燒杯中，加入1.0-2.0ml1％HAuCl₄水溶液，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌均勻，開啟加熱至溶液沸騰，迅速加入1.0-1.5ml新制備的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱，溶液逐漸變為藍黑色，然后紫黑，再加熱出現紅色，繼續煮沸出現透明的酒紅色，繼續煮沸5-10min，自然冷卻至室溫，加超純水至100ml，4℃避光保存，即為40nm膠體金；

(2)制備膠體金標記的鼠抗CP4 EPSPS單克隆抗體(標簽抗體1)和鼠抗Bt Cry1Ab/Ac單克隆抗體(標簽抗體2)

①取1ml制取好的膠體金，用0.02M的K₂CO₃調節pH到8.0，先加入50μgCP4 EPSPS鼠抗單克隆抗體(標簽抗體1)，再加入50μg Bt Cry1Ab/Ac鼠抗單克隆抗體(標簽抗體2)，混合均勻，室溫反應40min，加入BSA至終濃度為1％，靜置30min；

②取0.01-0.05M Tris、1-10％海藻糖、1-10％蔗糖在pH為8.5的環境下配制金標抗體稀釋液。將①中液體在4℃、12000rpm條件下，離心30min，仔細吸出上層清液，沉淀物用0.05-0.5ml標簽抗體稀釋液復溶，4℃保存，得到膠體金標記的鼠抗CP4 EPSPS單克隆抗體(標簽抗體1)和鼠抗Bt Cry1Ab/Ac單克隆抗體(標簽抗體2)；

(3)雙轉基因蛋白CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac的快速檢測試紙卡的制作

①取0.01-0.05M Tris、1-10％PVP、1-10％BSA、1-10％蔗糖在pH8.5的環境下配制金標墊處理液；

②取0.1-0.5M Tris、1-10％PVP、1-5％Tween-20、1-10％蔗糖在pH8.5的環境下配制玻纖處理液；

③將玻纖用玻纖處理液處理2h，烘干備用，即為樣品墊；將金標墊用金標墊處理液處理2h，烘干備用；

④在底板上按照常規的方式依次并排粘貼樣品墊和固定有膠體金標記的特異性單克隆抗體的金標墊、硝酸纖維素膜以及吸水紙；在金標墊上固定鼠抗CP4 EPSPS單克隆抗體(標簽抗體1)和鼠抗Bt Cry1Ab/Ac單克隆抗體(標簽抗體2)，在硝酸纖維素膜上的檢測區T1處固定1-2mg/ml鼠抗CP4 EPSPS單克隆抗體(包被抗體1)、T2處固定1-2mg/ml鼠抗BtCry1Ab/Ac單克隆抗體(包被抗體2)，在C處固定羊抗鼠IgG二抗0.5-1mg/ml，然后靜置在37℃真空干燥1h；

⑤將上述試紙條裁剪成4mm寬度的條子，然后裝在特制卡殼中，做成試紙卡。