[發(fā)明專(zhuān)利]CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測(cè)試紙卡及其制備和使用方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011246354.6
• 申請(qǐng)日: 2020-11-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112485437A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉雨晴;周興智;佟曄;魏計(jì)東;閻紅;葛祥武
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 基因賽奧（大連）生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/577;G01N33/573;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 沈陽(yáng)天贏專(zhuān)利代理有限公司 21251
• 代理人: 李榮新

1.CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測(cè)試紙卡，其特征在于：所述測(cè)試紙卡包括卡殼(1)和試紙條(2)，所述試紙條(2)主體為底板(3)，所述底板(3)上依次設(shè)置樣品墊(4)、金標(biāo)墊(5)、硝酸纖維素膜(6)和吸水紙(7)，所述硝酸纖維素膜(6)上設(shè)置T1線(6-2)、T2線(6-3)和C線(6-1)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測(cè)試紙卡，其特征在于：所述金標(biāo)墊(5)上固定有膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測(cè)試紙卡，其特征在于：所述T1線(6-2)處固定有1-2mg/ml鼠抗CP4 EPSPS單克隆抗體，所述T2線(6-3)處固定有1-2mg/ml鼠抗Bt Cry1Ab/Ac單克隆抗體；C線(6-1)處固定有0.5-1mg/ml的羊抗鼠IgG二抗。

4.CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac雙蛋白速測(cè)試紙卡的制備方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

(1)制備40nm膠體金

①將500ml燒杯、20ml小燒杯、轉(zhuǎn)子、棕色瓶、玻璃棒等洗凈后放入酸缸中浸泡24小時(shí)，取出先用自來(lái)水沖洗3-4次，再用超純水沖洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干備用；

②用塑料稱(chēng)量匙稱(chēng)取0.5-2g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入100ml超純水溶解，4℃避光保存；稱(chēng)取0.1g檸檬酸三鈉溶解于10ml超純水中，混合均勻備用；

③量取100ml超純水于燒杯中，加入1.0-2.0ml1％HAuCl₄水溶液，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌均勻，開(kāi)啟加熱至溶液沸騰，迅速加入1.0-1.5ml新制備的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌加熱，溶液逐漸變?yōu)樗{(lán)黑色，然后紫黑，再加熱出現(xiàn)紅色，繼續(xù)煮沸出現(xiàn)透明的酒紅色，繼續(xù)煮沸5-10min，自然冷卻至室溫，加超純水至100ml，4℃避光保存，即為40nm膠體金；

(2)制備膠體金標(biāo)記的鼠抗CP4 EPSPS單克隆抗體(標(biāo)簽抗體1)和鼠抗Bt Cry1Ab/Ac單克隆抗體(標(biāo)簽抗體2)

①取1ml制取好的膠體金，用0.02M的K₂CO₃調(diào)節(jié)pH到8.0，先加入50μgCP4 EPSPS鼠抗單克隆抗體(標(biāo)簽抗體1)，再加入50μg Bt Cry1Ab/Ac鼠抗單克隆抗體(標(biāo)簽抗體2)，混合均勻，室溫反應(yīng)40min，加入BSA至終濃度為1％，靜置30min；

②取0.01-0.05M Tris、1-10％海藻糖、1-10％蔗糖在pH為8.5的環(huán)境下配制金標(biāo)抗體稀釋液。將①中液體在4℃、12000rpm條件下，離心30min，仔細(xì)吸出上層清液，沉淀物用0.05-0.5ml標(biāo)簽抗體稀釋液復(fù)溶，4℃保存，得到膠體金標(biāo)記的鼠抗CP4 EPSPS單克隆抗體(標(biāo)簽抗體1)和鼠抗Bt Cry1Ab/Ac單克隆抗體(標(biāo)簽抗體2)；

(3)雙轉(zhuǎn)基因蛋白CP4 EPSPS和Bt Cry1Ab/Ac的快速檢測(cè)試紙卡的制作

①取0.01-0.05M Tris、1-10％PVP、1-10％BSA、1-10％蔗糖在pH8.5的環(huán)境下配制金標(biāo)墊處理液；

②取0.1-0.5M Tris、1-10％PVP、1-5％Tween-20、1-10％蔗糖在pH8.5的環(huán)境下配制玻纖處理液；

③將玻纖用玻纖處理液處理2h，烘干備用，即為樣品墊；將金標(biāo)墊用金標(biāo)墊處理液處理2h，烘干備用；

④在底板上按照常規(guī)的方式依次并排粘貼樣品墊和固定有膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體的金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜以及吸水紙；在金標(biāo)墊上固定鼠抗CP4 EPSPS單克隆抗體(標(biāo)簽抗體1)和鼠抗Bt Cry1Ab/Ac單克隆抗體(標(biāo)簽抗體2)，在硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)T1處固定1-2mg/ml鼠抗CP4 EPSPS單克隆抗體(包被抗體1)、T2處固定1-2mg/ml鼠抗BtCry1Ab/Ac單克隆抗體(包被抗體2)，在C處固定羊抗鼠IgG二抗0.5-1mg/ml，然后靜置在37℃真空干燥1h；

⑤將上述試紙條裁剪成4mm寬度的條子，然后裝在特制卡殼中，做成試紙卡。