[發明專利]一種表征COVID-19康復患者血漿中和抗體活性的間接ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 202011241648.X
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112526139A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 孔慶明;呂杭軍;袁亞杰;陸紹紅;高孟;卓洵輝;金子;丁豪杰;丁建祖;樓滌
• 申請（專利權）人: 杭州醫學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種檢表征COVID?19康復患者血漿中和抗體活性的間接ELISA檢測方法，包括以下步驟：(1)使用SARS?CoV?2病毒的RBD抗原與N抗原組合包被酶標板，包被后用封閉液進行封閉；(2)將待檢測COVID?19康復患者的血漿稀釋后加入步驟(1)處理好的酶標板中孵育；(3)洗板后，加入二抗孵育；(4)孵育后洗板，然后加入顯色液顯色后檢測吸光度值，吸光度值越高表明該待檢測COVID?19康復患者的血漿中和抗體活性越高。使用本申請建立的間接ELISA檢測方法不僅可以開展大規模人群的新冠IgG抗體檢測和新冠流行病學調查，同時也可以初步篩選潛在的具有高中和抗體滴度的新冠血漿供體，比在BSL3實驗室做中和實驗更加安全、方便和快速。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，特別是涉及一種表征COVID-19康復患者血漿中和抗體活性的間接ELISA檢測方法。

背景技術

SARS-CoV-2由于傳播速度快、傳染性強導致全球大流行。截至目前，臨床上仍缺乏有效的治療措施。歷史經驗證明，在缺乏藥物及疫苗的情況下，恢復期血漿(convalescentplasma，CP)療法也被稱為被動免疫療法可以作為一種治療選擇，并已成功應用于2003年的SARS-CoV和2012年的MERS-CoV兩種冠狀病毒引發的疾病。CP中含有相應病原微生物的特異性中和抗體(Neutralizing Antibody)，能夠與微生物表面的抗原結合，從而阻止該病原微生物黏附靶細胞受體，防止其侵入細胞。

SARS-CoV-2是一種能夠感染人的單股正鏈RNA病毒，冠狀病毒科β屬，基因組大小約29.9kb，編碼刺突糖蛋白(Spick，S)、膜蛋白(Membrane，M)、包膜蛋白(Envelope，E)以及核蛋白(Nucleocapsid，N)4種結構蛋白。刺突蛋白S上的受體結合域RBD通過與血管緊張素轉換酶2(Angiotensin-converting enzyme，ACE2)受體結合介導病毒入侵宿主細胞，是刺激機體產生中和抗體的核心抗原。

CP供者信息、有效成分和質量控制以及受者指征是決定治療效果的關鍵因素。輸注前，CP中抗SARS-CoV-2的中和抗體水平檢測尤為重要。目前，病毒中和實驗是評估血漿中和抗體滴度唯一有效、準確的方法，但是該方法使用的是真病毒，具有一定的危險性。此外，中和實驗需要在BSL-3級生物安全實驗室操作，對設備與操作人員要求較高，多數單位無法達到。雖然有研究報道假病毒中和實驗可以避免活病毒操作的危險性，但是假病毒中和實驗需要細胞培養、制備過表達ACE2細胞系以及細胞轉染等一系列繁瑣的實驗操作，耗時較長。在檢測臨床血漿中和抗體時，難以實現大規模、快速檢測。間接ELISA具有快速、簡單和靈敏度高的優點，適合基層單位和醫院的大規模篩查。考慮到中和實驗的不足，我們嘗試建立表征血漿中抗SARS-CoV-2中和抗體的間接ELISA方法。

公開號為CN111337689A的發明專利申請公開了一種新型冠狀病毒檢測試劑盒，包括底板，以及固定在所述底板上的包被有抗原的膠體金墊、設置有質控線和檢測線的NC膜、吸水墊和樣品墊，其中，在所述NC膜的檢測線端依次固定膠體金墊和樣品墊，質控線端固定吸水墊，其特征是在所述膠體金墊上包被的抗原是由膠體金標記的N蛋白和膠體金標記的S-RBD蛋白混合組成的混合抗原蛋白，所述NC膜上設置的檢測線為小鼠抗人IgM抗體和小鼠抗人IgG抗體檢測線。然而，該現有技術中試劑盒用于檢測是否感染新型冠狀病毒，是一種定性檢測方法，并不能用于表征COVID-19康復患者血漿中和抗體活性，無法實現定量檢測CP中IgG抗體水平。

發明內容

本發明針對現有技術中存在的上述不足，提供了一種表征COVID-19康復患者血漿中和抗體活性的間接ELISA檢測方法。

一種表征COVID-19康復患者血漿中和抗體活性的間接ELISA檢測方法，包括以下步驟：

(1)使用SARS-CoV-2病毒的RBD抗原與N抗原組合包被酶標板，包被后用封閉液進行封閉；