[發(fā)明專利]提高重組大腸桿菌中2’-巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011240682.5
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112322565A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉龍;陳堅;劉振民;堵國成;李江華;呂雪芹;蘇米亞;林璐;房峻
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);光明乳業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/62;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明公開了一種提高重組大腸桿菌中2’?巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用柔性Linker將四種不同蛋白標簽分別融合在α?1,2?巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FutC的N端，構(gòu)建的融合蛋白FP?futC可以不同程度地提高α?1,2?巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成2'?FL的產(chǎn)量。其中，采用TrxA?futC融合蛋白合成2'?FL的產(chǎn)量最高，達到2.94g/L，底物乳糖的消耗達到3.55g/L，乳糖轉(zhuǎn)化率為0.58mol/mol。而在對照組中，不加蛋白標簽構(gòu)建的質(zhì)粒pMA09?futC獲得的重組大腸桿菌合成2'?FL的產(chǎn)量僅為1.71g/L，乳糖消耗量為2.88g/L，乳糖轉(zhuǎn)化率僅為0.42mol/mol。進一步將TrxA?futC融合蛋白基因整合至大腸桿菌MG1655基因組上的yjiP位點，獲得一株無質(zhì)粒的2'?FL基因工程菌株MG?26△yjiP::trxA?futC，搖瓶發(fā)酵后2'?FL的產(chǎn)量達到3.85g/L，乳糖轉(zhuǎn)化率為0.68mol/mol。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提高重組大腸桿菌中2’-巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人乳低聚糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)是一類母乳中含量僅次于脂肪和乳糖的新型功能性糖源，可以促進新生兒中有益腸道細菌的生長，增強腸道的屏障功能，對新生兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育起著重要作用。HMOs具有多種核心單糖結(jié)構(gòu)單元，根據(jù)構(gòu)成HMOs單糖結(jié)構(gòu)單元的不同空間構(gòu)型、糖基序列、鏈長等，在糖鏈的不同位點上進一步巖藻糖化或唾液酸化，可以形成各種結(jié)構(gòu)的HMOs，目前已鑒定出大約200種HMOs分子，其中，以中性巖藻糖基化HMOs為主。2'-巖藻糖基乳糖(2'-FL)是人乳中含量最豐富的一類巖藻糖基低聚糖，已被美國食品和藥物管理局(FDA)批準為GRAS級別的HMOs，可作為高檔嬰配奶粉的營養(yǎng)補充劑，是目前最具商業(yè)價值的一種巖藻糖基乳糖。

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Fucosyltranferase,FucTs,EC 2.4.1.69)廣泛地分布于植物、脊椎動物和細菌中，通常是將巖藻糖從供體底物巖藻糖鳥苷二磷酸(GDP-L-fucose,GDP-L-Fuc)轉(zhuǎn)移至寡糖、糖蛋白和糖脂等糖受體底物上，催化糖綴合物的巖藻糖基化。根據(jù)反應(yīng)過程中形成的不同糖苷鍵，F(xiàn)ucTs可以分成α-1,2-FucT、α-1,3/4-FucT、α-1,6-FucT和O-FucTs四個亞家族。α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1,2-FucT)屬于CAZY家族11，催化巖藻糖從供體底物GDP-L-Fuc轉(zhuǎn)移到受體底物，如Galβ1,4Glc NAc或Galβ1,3Glc NAc的半乳糖基上，形成α-1,2-糖苷鍵。其中，巖藻糖基化的2'-FL是通過α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶催化巖藻糖從GDP-L-Fuc轉(zhuǎn)移到底物乳糖的半乳糖基上形成的(圖1)。