[發明專利]一種在大腸桿菌中表達的有機磷水解酶基因組及其應用

在審

• 申請號: 202011239856.6
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112342223A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 許晶;田永生;王波;高建杰;王麗娟;李振軍;彭日荷;姚泉洪
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C02F3/34;C12R1/19;C02F101/34;C02F101/38
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

一種在大腸桿菌中表達的有機磷水解酶基因組及其應用，包括源于黃桿菌并按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后獲得的OpdS基因、源于假單胞菌并按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后獲得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1?6所示，優化后獲得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因分別與T7啟動子和終止子融合，構建對應的基因表達盒，再連接入大腸桿菌表達載體，并轉化至大腸桿菌，在大腸桿菌中成功表達，獲得的陽性菌株對有機磷農藥甲基對硫磷和甲基對氧磷具有良好的降解作用。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種在大腸桿菌中表達的有機磷水解酶基因組及其應用。

背景技術

現代農業生產中，農藥在保證農業生產中有著不可估量的作用。使用最多的有機農藥主要是有機氯農藥和有機磷農藥。但是，自20世紀60年代以來，許多國家開始禁止或限制使用有機氯農藥。因此，高效、低成本的有機磷農藥作為有機氯的替代農藥而迅速在國內外大量生產和使用，并發展為目前應用最廣、品種最多的農藥之一。

有機磷農藥，通常是指磷酸酯或硫代磷酸酯類有機化合物。甲基對硫磷是有機磷農藥中的其中一種較為常見的殺蟲劑，被廣泛用于防治水稻、棉花、果樹、茶葉、蔬菜等害蟲。由于其具有高毒性的特點，我國已于2007年起禁止在農業范圍使用，但仍保留部分企業出口生產的能力。雖然已停止甲基對硫磷的使用，但由于其在環境中殘留仍然比較嚴重，并且部分地區仍有禁而不止的現象發生，故有機磷殺蟲劑的殘留污染問題認識目前亟待解決的嚴重問題之一。

微生物具有極強的變異性和適應性等特點，成為了自然環境中降解有機磷農藥的主要成員。目前，已分離出的能降解有機磷的微生物有細菌、放線菌、真菌、藻類等。

微生物對甲基對硫磷和甲基對氧磷的代謝，初始反應一般為水解反應，即在水解酶的作用下一個磷硫酯鍵斷裂，生成一種無毒化合物和對硝基苯酚PNP。PNP的毒性雖與母體相比下降了100倍，但由于其含有苯環結構，殘留時間很長，對環境和人類的毒性也很大。目前已分離出的一些能夠降解甲基對硫磷的細菌和真菌，并不能繼續降解PNP。因此，需要尋求另一種方法來實現甲基對硫磷的完全降解。

發明內容

本發明的目的在于提供一種在大腸桿菌中表達的有機磷水解酶基因組及其應用，利用合成生物學技術將不同來源的基因片段進行設計、改造，將完整的異源分解代謝途徑引入到大腸桿菌中，從而使大腸桿菌具備降解和耐受甲基對硫磷、甲基對氧磷的功能，提高細菌對有機磷農藥的降解效率和耐受能力，豐富工業應用降解菌資源。

為了達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種在大腸桿菌中表達的有機磷水解酶基因組，包括源于黃桿菌并按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后獲得的OpdS基因、源于假單胞菌并按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后獲得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因。

進一步，按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后，所述OpdS基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示；PnpAS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；PnpBS基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示；PnpCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；PnpDS基因的核苷酸序列如SEQID No.5所示；PnpES基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本發明提供所述有機磷農藥的基因組合在大腸桿菌中的應用。

一種多基因大腸桿菌轉化載體，包括大腸桿菌表達載體，以及源于黃桿菌并按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后獲得的OpdS基因、源于假單胞菌并按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后獲得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因分別與T7啟動子和終止子融合的基因表達盒。

優選地，所述大腸桿菌表達載體為pET-28a。