[發明專利]一種在大腸桿菌中表達的有機磷水解酶基因組及其應用

在審

• 申請號: 202011239856.6
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112342223A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 許晶;田永生;王波;高建杰;王麗娟;李振軍;彭日荷;姚泉洪
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C02F3/34;C12R1/19;C02F101/34;C02F101/38
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

1.一種在大腸桿菌中表達的有機磷水解酶基因組，包括源于黃桿菌并按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后獲得的OpdS基因、源于假單胞菌并按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后獲得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因。

2.根據權利要求1所述的有機磷水解酶基因組，其特征在于，所述OpdS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；PnpAS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；PnpBS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；PnpCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；PnpDS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；PnpES基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

3.如權利要求1所述的基因組合在大腸桿菌中的應用。

4.一種多基因大腸桿菌轉化載體，包括大腸桿菌表達載體，以及源于黃桿菌并按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后獲得的OpdS基因、源于假單胞菌并按大腸桿菌的密碼子偏好性優化后獲得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因分別與T7啟動子和終止子融合的基因表達盒。

5.根據權利要求4所述的多基因大腸桿菌轉化載體，其特征在于，所述大腸桿菌表達載體為pET-28a。

6.一種可完全降解有機磷農藥的轉基因大腸桿菌的制備方法，包括以下步驟：

1)根據大腸桿菌的密碼子偏好性，對源于黃桿菌的Opd基因、源于假單胞菌的PnpA基因、PnpB基因、PnpC基因、PnpD基因和PnpE基因按大腸桿菌表達模式優化，優化后分別獲得OpdS基因、PnpAS基因、PnpBS基因、PnpCS基因、PnpDS基因和PnpES基因，利用重疊延伸PCR技術，將優化后獲得的六段基因分別與T7啟動子和終止子融合，分別構建基因表達盒；

2)將步驟1)中構建的六個基因表達盒連接入大腸桿菌表達載體，獲得含OpdS、PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES六基因表達盒的多基因大腸桿菌轉化載體；

3)將步驟2)所述多基因大腸桿菌轉化載體轉入大腸桿菌，獲得能完全降解有機磷農藥甲基對硫磷和甲基對氧磷的大腸桿菌。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述OpdS基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；PnpAS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；PnpBS基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；PnpCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；PnpDS基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示；PnpES基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述T7啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述T7終止子序列如SEQ ID NO.8所示。

9.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，所述大腸桿菌表達載體為pET-28a。

10.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中，所述大腸桿菌為BL21-AI。