[發明專利]一種基于斑馬魚炎癥性腸病模型篩選藥效物質的方法

有效

• 申請號: 202011239439.1
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112245596B
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發明（設計）人: 王毅;趙璐
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;C12Q1/02
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 韓聰

本發明公開了一種基于斑馬魚炎癥性腸病模型篩選藥效物質的方法，屬于藥物篩選技術領域。所述方法包括：(1)將待測物質加入到含有斑馬魚胚胎的孵育液A中預保護，再換液加入含有三硝基苯磺酸的孵育液B，繼續孵育，得到給藥模型；(2)利用與活性氧反應的熒光染料對給藥模型的斑馬魚胚胎進行處理，熒光成像并分析斑馬魚胚胎腸道區域內的平均熒光強度，與未給藥模型組的活性氧水平進行比較，篩選具有統計學差異的物質作為目標物質。本發明成功構建了斑馬魚炎癥性腸病模型，利用顯微成像技術顯示表型變化，將其應用于治療炎癥性腸病藥物的篩選，顯著提高了篩選效率、縮短了篩選時間。

技術領域

本發明涉及藥物篩選與評價技術領域，具體涉及一種基于斑馬魚炎癥性腸病模型篩選或評價藥效物質的方法。

背景技術

炎癥性腸病(IBD)是表現為慢性或復發的免疫反應和炎癥癥狀的胃腸道疾病的總稱，包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)，目前無法治愈。臨床治療用藥主要包括氨基水楊酸類、皮質類固醇類、免疫抑制劑、生物制劑等,但由于炎癥性腸病復雜的發病機制和病因學，現有臨床藥物存在治療效果不佳及價格昂貴等缺點。

在炎癥性腸病的臨床治療中，中藥發揮整體調節和綜合治療的優勢,具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、免疫調節等多種生物活性及藥理作用，能顯著改善腹瀉、腹痛、便血等腸炎癥狀，在臨床患者的治療當中起到緩解癥狀的效果，其多途徑、多靶點、整體性的作用特點在炎癥性腸病的治療防治中獨具優勢。

迄今為止，IBD中最完善的模型是小鼠模型，它作為一種有價值的動物模型，在腸道菌群、免疫反應、感染、遺傳等方面對IBD的認識做出了很大的貢獻。但是小鼠模型也存在一定的局限性，比如病理變化不能通過連續觀察來確定、遺傳操作困難、通量小、速度慢等。近幾年來，斑馬魚由于其高產卵率和胚胎體外受精發育等優勢，在藥物篩選領域受到研究者們的青睞，如專利文獻CN 108719145 A、CN106755099 A。斑馬魚與人類基因同源性約為80％，且其腸道早期發育與人類腸道發育過程高度相似，可以成為研究炎癥性腸病及胃腸疾病的有利工具。

熒光成像技術是利用激發光使得熒光基團達到較高的能量水平,然后發射出較長波長的光這一原理進行檢測。目前常用的熒光基團有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(Ds Red)等。活體熒光成像技術可從整體上展示完整的自然狀態下的生物，與其他的活體內成像技術相比，熒光成像技術有著敏感度高、安全易操作、結果直觀、數據真實可靠、費用低廉等優點，已被廣泛應用于生命科學、醫學研究及藥物開發等領域。

發明內容

本發明的目的是提供一種斑馬魚炎癥性腸病模型，利用該模型結合成像技術和分子生物學技術用于篩選和評價天然產物以及化學合成藥物中對炎癥性腸病具有治療作用的物質。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種基于斑馬魚炎癥性腸病模型篩選藥效物質的方法，包括以下步驟：

(1)將待測物質加入到含有斑馬魚胚胎的孵育液A中進行預保護，再換液加入含有三硝基苯磺酸的孵育液B，繼續孵育，得到給藥模型；

(2)利用與活性氧反應的熒光染料對給藥模型的斑馬魚胚胎進行處理，熒光成像并分析斑馬魚胚胎腸道區域內的平均熒光強度，與未給藥模型組的活性氧水平進行比較，篩選具有統計學差異的物質作為目標物質。

當斑馬魚模型的腸道發生炎癥反應，其活性氧(ROS)水平顯著上升。利用對炎癥性腸病具有治療作用的物質對斑馬魚胚胎先進行預保護，再造模，相較于未進行預保護的模型組，其活性氧水平呈現下降趨勢，因此，本申請通過檢測活性氧水平的變化情況來判斷待測物質是否對炎癥性腸病具有治療或預防作用，從而篩選出對炎癥性腸病具有治療作用的藥效物質。