[發明專利]一種病原體微生物宏基因組去宿主方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202011238096.7
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112322701A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 胡彬;王燁鳳;褚嘉豪;蔡媛媛
• 申請（專利權）人: 紹興迅敏康生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 無錫市匯誠永信專利代理事務所(普通合伙) 32260
• 代理人: 李珍珍

本發明提供一種病原體微生物宏基因組去宿主方法及試劑盒，特別適用于肺泡灌洗液、腦脊液、痰液以及腹水等病原微生物宏基因組檢測，利用人細胞和細菌，真菌，病毒等細胞結構不一致及人細胞濃度，基因組大小與真菌，細菌，病毒濃度及基因組大小有顯著差異的特點，選擇變性劑溶解細胞和酶消化人細胞核酸，以達到去宿主的作用，其中變性劑至少包括saponin、吐溫20、Triton X?100、digitonin以及CHAPS的一種或多種；該病原體微生物宏基因組可在5?20分鐘內完成去宿主操作，該方法可提高病原體微生物宏基因組的檢測靈敏度。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，特別涉及一種病原體微生物宏基因組去宿主方法及試劑盒。

背景技術

高通量測序技術〔又稱下一代測序技術(NGS)〕越來越廣泛地應用于感染性疾病的溯源、檢測、分型和耐藥評估等各個方面，并且朝著快捷、經濟的方向飛速發展。2008年和2011年，Palacios等人與Xu等人分別采用宏基因組及宏轉錄組發現了兩個臨床感染病例的新發病原體，分別為沙粒病毒和新型布尼亞病毒，開啟了宏基因組學測序(mNGS)技術在臨床感染中應用的先例。由于mNGS不依賴于特定基因引物的序列擴增，而是將待測樣本的所有DNA或RNA混合測序，并通過將測序數據與病原體數據庫進行比對，獲得病原體的分類信息，因此能在較短的時間內完成對樣本的無靶向檢測，單次即可檢測上千種病原體，檢測的病原體種類包含病毒、細菌、真菌和寄生蟲等。

然而，大多數的臨床樣本，比如肺泡灌洗液，腦脊液被廣泛應用于宏基組病原微生物檢測，然而此類樣本中含有大量人細胞，且人細胞基因組為病原體微生物的10-10000倍，導致宏基組測序得到測序數據90％以上的測序序列為人源序列，從而大大影響宏基因組病原微生物檢出靈敏度，如何高效地去宿主化提取是臨床病原微生物宏基因組測序的關鍵。

目前常用的去宿主方法有：過濾法，將樣本通過5um的微濾膜進行過濾取過濾后樣本進行宏基組測序，然后測試結果與未過濾測試結果人源序列占比無顯著差異，且病原微生物檢測率也無顯著差異。酶切法，將樣本直接用DNaseⅠ進行消化后，然后進行宏基組測試，雖然測試結果中人源序列占比稍微有所下降，但病原微生物檢測序列無顯著提高。探針捕獲法，設計反向特異性的捕獲人源基因組，然后將剩余的樣本用于檢測，該方法成本高，流程較長，且效果較差。

另外，針對不同的病原微生物的去宿主還需考慮到病原微生物本身的特性，病原微生物的去宿主方法之間也難以直接相通借用。比如針對痰液樣本來說，由于其內含有大量的粘液、細胞及蛋白、病原微生物被包裹在痰液中，因此對其去宿主的過程需要先對痰液進行液化，然而在痰液液化的過程雖然可以富集細菌、真菌等病原體，但同時也會導致人細胞富集、病毒、衣原體、寄生蟲等病原體減少，因此特別針對痰液的去宿主方法并不一定適用于針對病毒的去宿主方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種病原體微生物宏基因組去宿主方法及試劑盒，特別適用于肺泡灌洗液、腦脊液等病原微生物宏基因組檢測，利用人細胞和細菌，真菌，病毒等細胞結構不一致及人細胞濃度，基因組大小與真菌，細菌，病毒濃度及基因組大小有顯著差異的特點，選擇特異性的變性劑溶解細胞并酶消化人細胞核酸，可在5-20分鐘內達到去宿主的作用，可提高病原體微生物宏基因組的檢測靈敏度。

為了實現以上目的，第一方面，本方案提供一種病原體微生物宏基組去宿主提取方法，特別適用于肺泡灌洗液、腦脊液、痰液、腹水等病原微生物宏基組檢測，包括：

宿主細胞裂解：取檢測樣本加入變性劑孵育去人源細胞得到第一反應液，其中變性劑至少包括皂素(saponin)、聚氧乙烯(20)山梨醇酐單月桂酸酯(吐溫20)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、毛地黃皂苷(digitonin)以及CHAPS的一種或多種，這些變性劑的共性是可溫和地破裂人細胞；

宿主核酸去除：配置添加有DNaseⅠ酶的緩沖液，混合第一反應液和添加有DNaseⅠ酶的緩沖液孵育去除宿主核酸，得到第二反應液；