[發明專利]一種基于RAA熒光法快速檢測肺炎克雷伯菌的靶點、引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 202011237896.7
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112266969A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 李可;張曉峰;帥江冰;郭利川;張萌萌;應清界
• 申請（專利權）人: 浙江省檢驗檢疫科學技術研究院;江蘇奇天基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/22
• 代理公司: 杭州恒翌專利代理事務所(特殊普通合伙) 33298
• 代理人: 王從友

1.一種檢測肺炎克雷伯菌（Enterobacter sakazakii）用的靶點基因，其特征在于，該靶點基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.擴增權利要求1所述的靶點基因的引物，其特征在于，所述的引物包括上游引物和下游引物，其中，上游引物核苷酸序列為：CAGCGACGCAGGCAGCGGAAGTTTATAATAAG，下游引物核苷酸序列為：TACCGCAGAATTCAGATTCCCAACGGCCATAG。

3.檢測權利要求1所述的靶點基因的探針，其特征在于，所述的探針序列為5’端序列/熒光報告基團/A/THF/G/淬滅基團/3’端序列，其中：所述5’端的核苷酸序列為：CTATGACAGCAAGGATGGCGATCAGACC；所述3’端的核苷酸序列為：GCGTTTCGGTATTAAAG；所述THF為1個堿基位置；優選，所述熒光報告基團選自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3 或Cy5中的任一種；所述淬滅基團選自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或DABCYL中的任一種；最優選，熒光修飾基團為FAM，熒光淬滅基團為BHQ1。

4.檢測權利要求1所述的靶點基因的探針，其特征在于，所述探針序列為 ：CTATGACAGCAAGGATGGCGATCAGACCTACGTGCGTTTCGGTATTAAAG。

5.基于RAA熒光法檢測肺炎克雷伯菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括RAA基礎熒光通用反應試劑、反應緩沖液、陰性質控品、陽性質控品和用于擴增權利要求1所述的靶點基因的引物和用于檢測權利要求1所述的靶點基因的探針。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，引物為權利要求2所述的引物，探針為權利要求3或4所述的探針。

7.根據權利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于，所述引物中上游引物和下游引物的濃度獨立為0.05~0.1 mmol/L；所述探針的濃度為0.02~0.05mmol/L。

8.根據權利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于，所述反應緩沖液包括以下含量組分：濃度為500 mmol/L，PH值7.4的Tris-HCl 緩沖液、濃度為240 mmol/L的MgAc和質量分數為10%的PEG 10000；所述陽性質控品中含有肺炎克雷伯菌的基因組DNA；所述肺炎克雷伯菌的基因組DNA的濃度為1×10⁴ Copies/ul；所述陰性質控品為ddH₂O或純化水。

9.權利要求1所述的靶點基因、權利要求2所述的引物或權利要求3或4所述的探針在制備基于RAA熒光法檢測肺炎克雷伯菌的試劑盒中的應用。

10.一種采用權利要求5-8任意一項權利要求所述的試劑盒檢測食品中肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

1）提取待測樣品的DNA，提到得到的核酸樣本于-20℃條件下保存備用；

2）將檢測儀器RAA-F1620接通電源進行預熱，對反應參數進行設置，反應參數設置為39℃，反應時間：20 min；

3）在42.6 μL反應緩沖液中加入1 μL探針和1 μL引物，混合后添加到RAA基礎熒光通用反應試劑中混合；得到反應預混液；

4）將5 μL所述步驟1）中得到的DNA提取液與所述步驟3）中得到的反應混合液充分混合，得到的反應體系進行放入檢測儀器RAA-F1620進行檢測熒光信號；

5）根據RAA-F1620檢測儀器中的陽性判定方法，將斜率值K≥20時，判定為陽性，斜率值K＜20時判定為陰性。