[發明專利]一種基于RAA熒光法快速檢測肺炎克雷伯菌的靶點、引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 202011237896.7
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112266969A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 李可;張曉峰;帥江冰;郭利川;張萌萌;應清界
• 申請（專利權）人: 浙江省檢驗檢疫科學技術研究院;江蘇奇天基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/22
• 代理公司: 杭州恒翌專利代理事務所(特殊普通合伙) 33298
• 代理人: 王從友

本申請屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種肺炎克雷伯菌基因高度保守序列及其檢測引物探針和試劑盒。一種檢測肺炎克雷伯菌（Enterobacter sakazakii）用的靶點基因，該靶點基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本申請基于肺炎克雷伯菌基因高度保守序列設計的引物探針適用于RAA熒光法檢測，并且能夠準確地檢測出肺炎克雷伯菌，特異性達100%。本申請還提供了一種基于RAA熒光法檢測肺炎克雷伯菌的試劑盒，所述試劑盒能夠方便準確地鑒定肺炎克雷伯菌的存在，20min內即可完成，在30~42℃下進行等溫擴增即可完成檢測。

技術領域

本申請屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種基于RAA熒光法快速檢測肺炎克雷伯菌的靶點、引物、探針及試劑盒。

背景技術

肺炎克雷伯菌(Enterobacter sakazakii)屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，1882年Friedlan der從大葉性肺炎患者痰液中首次分離出肺炎克雷伯氏菌。肺炎克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，無鞭毛，無芽孢，在營養豐富的培養基上可形成莢膜。多數菌株有菌毛，具有菌體抗原、莢膜抗原、菌毛抗原等多種主要抗原成分。該菌為兼性厭氧菌，營養要求不高，在培養基上可形成較大、凸起、灰白色粘液型的菌落。

肺炎克雷伯菌，是一種最重要條件致病菌之一，廣泛存在于水和土壤等微生態環境中，易在住院患者呼吸道和腸道定植，在機體免疫力低下時可引起多種部位感染，包括肺炎、泌尿道感染、腹腔內感染、化膿性肝囊腫、新生兒腦膜炎和菌血癥等。肺炎克雷伯菌是引起醫院內肺炎的主要病原菌，在我國肺炎克雷伯菌是院內感染的第二大致病菌，占9.03％，它能累及多個肺葉并引起肺膿脾，所以該肺炎是一個快速進展的臨床過程，只有短暫的時間留給臨床來建立有效的抗菌治療方案。盡管病患已經給予經驗治療，但死亡率還是超過了50％。近年來，由于這些典型的肺炎克雷伯菌株出現了耐藥情況，且呈上升趨勢，使得該菌在臨床治療上極為棘手。最近有報道稱，一種新的高毒性的肺炎克雷伯菌變種已經出現，它的臨床特征為能在年輕的健康人群中引發嚴重的、威脅生命的社區獲得性感染。如果這些菌株也出現了耐藥趨勢，那么臨床治療將會面臨巨大的挑戰。因此，臨床迫切需要一種快速，準確和簡便的方法來鑒定出病原菌，以輔助臨床選擇有效的抗生素來減少致死率和耐藥菌株的出現。

細菌培養鑒定是目前常用的檢測肺炎克雷伯菌感染的方法，一般需經過涂片、分離培養、生化反應鑒定、血清學鑒定和腸毒素測定等環節。因此這種方法繁瑣且耗時耗力，而且同源菌株生化鑒定存在交叉反應，而血清學鑒定環節亦會因抗體效價低而導致假陰性，使得常規方法難以滿足臨床快速鑒定的要求和用藥選擇的需要。分子生物學方法如聚合酶鏈式反應(P CR)以及等溫核酸擴增技術中的LAMP法已經建立起來，并且在肺炎克雷伯菌的檢測上已得到較好的應用，大大縮短了檢測的時間。PCR技術如實時定量PCR以其高度的特異性及敏感性在肺炎克雷伯菌檢測方面取得了重大的突破。但是這些方法需要使用復雜的儀器和裝備精良的實驗室。LAMP方法克服了PCR技術需要昂貴的設備儀器等缺點，具有操作簡便，結果判斷簡單等優點，已應用于肺炎克雷伯菌的檢測。但是，LAMP技術要求多對引物且對靶基因的要求較高且假陽性較高。

本申請基于重組酶介導的等溫核酸擴增技術(簡稱為RAA技術)設計特異引物和探針，并建立基于RAA熒光法快速檢測肺炎克雷伯菌的試劑盒。實現39℃下進行約20分鐘即可完成肺炎克雷伯菌的檢測，具有快速、靈敏、操作簡便等優勢，可適用于現場檢測，對食品中肺炎克雷伯菌的檢測具有重要意義。

發明內容

本申請的第一個目的在于提供檢測肺炎克雷伯菌(Enterobacter sakazakii)用的靶點基因，該靶點基因具有高度保守性，通過該靶點基因設計出用于檢測引物探針具有特異性強、靈敏度高、重復性好的特點，進一步設計成試劑盒，具有快速、靈敏、操作簡便等優勢，可適用于現場檢測，對食品中肺炎克雷伯菌的檢測具有重要意義。

為了實現上述第一個發明目的，本申請提供以下技術方案：