[發明專利]一種NK NK-T細胞的誘導擴增方法

有效

• 申請號: 202011235714.2
• 申請日: 2020-11-06
• 公開（公告）號: CN112359015B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 吳直江;戴懷建;戴小梅
• 申請（專利權）人: 上海映天生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 上海中外企專利代理事務所(特殊普通合伙) 31387
• 代理人: 牛怡

1.一種NK NK-T細胞的誘導擴增方法，其特征在于，包括免疫細胞NK NK-T的誘導、活化步驟和免疫細胞NK NK-T的大容量培養擴增步驟；

其中，免疫細胞NK NK-T的誘導、活化包括下列步驟：

S01：抽取50ml抗凝外周血步驟：采用12,500單位的肝素鈉1ml抗凝，排除枸櫞酸鈉抗凝；

S02：以 CD16單抗25-35μg、曲妥珠單抗1-2 mg誘導劑7ml包被T75培養瓶24小時，吸去包被液待用;

S03：所述50ml外周血分離得到血漿30ml，不需滅活;

S04：所述外周血分離得淋巴細胞3-5×10⁷置入包被的T75培養瓶，加入完全培養液30ml：AIM-V無血清培養基中含注射用重組人γ-干擾素（IFN-r）、注射用重組人白介素-2(IL-2)、重組人白介素-15(IL-15)、重組人白介素-21(IL-21)、重組人干細胞生長因子(SCF)、三磷酸腺苷二鈉注射液（ATP）、注射用輔酶A，其中細胞因子 IFN-r、IL-2、IL-15、IL-21、SCF均為1000U/ml；

以及加入3 ml自體血漿；

S05：24小時后，加入CD3單克隆抗體25-35 μg；

免疫細胞NK NK-T的大容量培養擴增包括下列步驟：

S201：72小時后誘導的細胞補液含3ml自體血漿的30ml完全培養液；

S202：第5天轉入T175培養瓶×1；

S203：第7天轉入T175培養瓶×2；

S204：第9天轉入T175培養瓶×4，補液總量達1000ml；

S205：第11天轉入容量為2000ml培養袋×2，各袋補液總量達1000ml；

S206：第13天各培養袋補液總量達4000ml；

S207：第15天可以收獲細胞，免疫細胞NK NK-T總量 ＞ 1×10¹⁰ ；

還包括免疫細胞NK NK-T的檢定步驟：

S301：收獲細胞的無菌、內毒素、支原體按中國藥典III 部檢定，均應合格；

S302：免疫細胞NK NK-T的流式細胞表型檢測：

CD16⁺56⁺/CD3^- NK細胞+ CD16⁺56⁺/CD3⁺ NK- T細胞≥ 35 %。