[發(fā)明專利]一種區(qū)分克氏原螯蝦特定地理群體的SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011234812.4
• 申請(qǐng)日: 2020-11-07
• 公開（公告）號(hào): CN112210612B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 白旭峰;蓬國(guó)輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所(普通合伙) 42001
• 代理人: 張紅兵

本發(fā)明屬于動(dòng)物分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種區(qū)分克氏原螯蝦特定地理群體的SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明特征為：分別提取來(lái)自中國(guó)14個(gè)地域群體的克氏原螯蝦基因組DNA；根據(jù)克氏原螯蝦基因組測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)克氏原螯蝦SSR引物，利用設(shè)計(jì)的SSR引物對(duì)采集樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增并得到目的片段，利用瓊脂糖膠電泳檢測(cè)目的片段是否被擴(kuò)增出；進(jìn)一步利用聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳檢測(cè)其PCR產(chǎn)物的帶型，對(duì)群體進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)分析；利用在PCM2076位點(diǎn)含有的等位基因A或含有的純合等位基因B的信息，比較樣本之間存在的基因型分布差異，從而用于不同地理群體克氏原螯蝦的分型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于養(yǎng)殖及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種區(qū)分克氏原螯蝦特定地理群體的SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明適用于我國(guó)鄱陽(yáng)湖及附近地域與長(zhǎng)江其他地域與微山湖地域的克氏原螯蝦群體的地理區(qū)分，應(yīng)用本發(fā)明可鑒定未知群體的來(lái)源是否屬于中國(guó)特定地理區(qū)域克氏原螯蝦群體。

技術(shù)背景

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)，屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、螯蝦科(ambaridae)，是存活于淡水中的一種甲殼類動(dòng)物，俗稱淡水小龍蝦。原產(chǎn)于美國(guó)南部和墨西哥東北部，經(jīng)由日本引入中國(guó)南京地區(qū)，后逐步向整個(gè)長(zhǎng)江流域等地區(qū)擴(kuò)散；目前，克氏原螯蝦已成為長(zhǎng)江中下游乃至全國(guó)范圍內(nèi)的重要經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品。

克氏原螯蝦由中國(guó)江蘇南京地區(qū)向長(zhǎng)江流域等地區(qū)擴(kuò)散的過(guò)程中，由于不同地域的環(huán)境條件差異，經(jīng)過(guò)90年的演變逐步形成了不同的地理群體。近年來(lái)，克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，形成了以江蘇盱眙和湖北潛江為中心的克氏原螯蝦養(yǎng)殖中心，繼而向全國(guó)擴(kuò)散的格局，由于不同地域相互引種，通過(guò)基因漸滲，導(dǎo)致各地的克氏原螯蝦野生種質(zhì)資源群體趨于同質(zhì)化。我國(guó)鄱陽(yáng)湖地域的克氏原螯蝦野生種質(zhì)資源保存相對(duì)完整，通過(guò)遺傳分析得知該地域水系的克氏原螯蝦群體具有較獨(dú)特的遺傳結(jié)構(gòu)(譚云飛等，2020)，該地域種質(zhì)資源對(duì)克氏原螯蝦的遺傳育種尤為重要。前述(譚云飛等，2020)，該文章的數(shù)據(jù)與結(jié)果使用的是前人公布的SSR標(biāo)記對(duì)采集的樣本進(jìn)行的遺傳多樣性分析；而本發(fā)明涉及的標(biāo)記PCM-2076屬于自主開發(fā)的分子標(biāo)記，與前文無(wú)關(guān)。再者前文并沒有對(duì)克氏原螯蝦分子標(biāo)記或者形態(tài)特征將其區(qū)別開來(lái)。

本發(fā)明的目的是開發(fā)了一個(gè)用于區(qū)分鄱陽(yáng)湖地域克氏原螯蝦群體的分子標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種不同地域克氏原螯蝦鑒別的分子標(biāo)記，本發(fā)明建立一種SSR(Simple Sequence Repeats)標(biāo)記特異鑒定鄱陽(yáng)湖地域克氏原螯蝦群體的方法，利用本發(fā)明制備的分子標(biāo)記和方法可以準(zhǔn)確區(qū)分中國(guó)部分區(qū)域例如鄱陽(yáng)湖地域及周邊地域，以及長(zhǎng)江流域其他地域的克氏原螯蝦群體，為特異鑒定我國(guó)不同地理群體小龍蝦群體提供了新的標(biāo)記和方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

一種區(qū)分克氏原螯蝦特定地理群體的SSR分子標(biāo)記的方法，所述的方法包括以下步驟：

(1)分別提取來(lái)自中國(guó)14個(gè)地域群體的克氏原螯蝦基因組DNA，每個(gè)群體至少提取22尾克氏原螯蝦的基因組DNA。

(2)設(shè)計(jì)引物：根據(jù)克氏原螯蝦基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用Primer3軟件設(shè)計(jì)正向引物PCM2076 F 5’-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3’，以及反向引物PCM2076R 5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3’。

(3)對(duì)14個(gè)中國(guó)地域群體的克氏原螯蝦的DNA樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體步驟為：

利用正向引物PCM2076 F 5'-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3'，和反向引物PCM2076R 5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3'擴(kuò)增目的片段，利用瓊脂糖電泳檢測(cè)目的片段是否被擴(kuò)增出。PCR條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；35次循環(huán)后，在72℃再延伸7min；4℃保存。