[發明專利]辣根過氧化物酶基因作為報告基因的應用

在審

• 申請號: 202011234692.8
• 申請日: 2020-11-07
• 公開（公告）號: CN112481279A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 項陽;李軍;余樂;張婭;周雪莉;李晉
• 申請（專利權）人: 武漢愛博泰克生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53
• 代理公司: 武漢世躍專利代理事務所(普通合伙) 42273
• 代理人: 倪婭

本發明公開了一種基于HRP報告基因的細胞因子活性的鑒定方法。該方法操作過程簡單快速，不依賴特定細胞，不依賴特殊培養基，不依賴熒光顯微鏡和化學發光的儀器，可以推廣到更普通的生物學實驗室，有很好的實用價值。由于使用報告基因細胞對少量的細胞因子引起的變化就能反映出來，這樣就能節約成本。細胞通路變化比細胞生長或者毒性實驗要快速，所以應用HRP報告基因能夠節約使寶貴的實驗時間。可以該方法為基礎，做成檢測細胞活性物質或轉染試劑的試劑盒。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地指一種辣根過氧化物酶基因作為報告基因的應用。

背景技術

各種化學分子、多肽、蛋白質等生物活性分子，能通過結合細胞表面的相應受體激活或者抑制信號通路，完成生物學功能作用。這些生物學活性包括：促進靶細胞的增殖和分化，增強抗感染和細胞殺傷效應，促進或抑制其他細胞因子和膜表面分子的表達，促進炎癥過程，影響細胞代謝等。這些生物活性分子已經廣泛的應用到科研試劑和藥物研發領域。因此，如何建立一個高效和穩定的生物活性分子的檢測體系是科研和生產的關鍵。

報告基因(Reporter gene)編碼著方便檢測的蛋白質或酶的基因，可用于檢測目的生物系統的變化，從而鑒定和并篩選得到需要的實驗結果。根據不同信號通路特征的，在特定的信號通路的DNA響應原件后加一個報告基因，在信號刺激的情況下，報告基因的表達會發生變化。常用的報告基因系統包括：熒光素酶基因(luc)、氯霉素乙酰轉移酶基因(cat)、綠色熒光蛋白基因(gfp)等。但是以上報告基因系統要么需要特殊的試劑和熒光讀取儀器，要么成本比較高，要么不能肉眼觀察，不方便實驗。因此研發新的報告基因檢測方法不僅可彌補其他檢測方法的不足，而且有望獲得更為簡便可靠的檢測方法，這對于客觀評價生物活性分子的活性具有重要的意義。

辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，簡稱為HRP)存在于植物辣根中，在生物化學領域有著廣泛地應用，主要是因為它具有將微弱信號放大及增強靶標分子可檢測度的能力。HRP做成產品不但廣泛用于多個生化檢測項目，也廣泛運用于免疫類(ELISA)試劑盒。

發明內容

本發明的目的在于提供一種辣根過氧化物酶基因作為報告基因的應用，為鑒定轉染試劑、化學分子、多肽、抗體、蛋白、抗體等的活性提供了新的思路，解決了現有檢測方法耗時長、步驟繁雜、成本昂貴、敏感性較低等缺點。

為實現上述目的，本發明所提供的辣根過氧化物酶基因作為報告基因的應用，其步驟為：首先設定待鑒定目標物，根據目標物和所激活的信號通路，確定所述信號通路對應的啟動子相應原件的DNA，將所述原件的DNA與HRP基因的聯合基因克隆到表達載體里，然后轉染細胞，再用單一或多種濃度的目標物處理轉染后的細胞，激活信號通路，使HRP基因表達，之后再加入HRP的顯色底物，進行定性或定量評價。

上述方案中，所述定量評價是通過多種濃度的目標物處理含有報告基因轉染后的細胞，檢測HRP顯色底物的顯色值，計算EC50值，以進行評價。

可選地，所述HRP的顯色底物為TMB。

上述方案中，所述待鑒定目標物選自轉染試劑、化學分子、多肽、抗體、蛋白、抗體中一種。

可選地，所述HRP基因的序列如基因庫GenBank中編號ANS10151.1所示。

本發明還提供了一種基于HRP報告基因的活性鑒定載體，所述載體上包含預設的HRP基因，且HRP基因前設有可編輯的啟動子插入位點。