[發明專利]基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 202011232177.6
• 申請日: 2020-11-06
• 公開（公告）號: CN112176096A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 朱麗媛;楊曉明;夏小凱;黃迎燕;程天齡;吉斯·丁格曼斯
• 申請（專利權）人: 上海捷諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京北匯律師事務所 11711
• 代理人: 高元吉

本發明公開基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒及其使用方法。本發明的試劑盒可以直接在臨床材料中檢測有臨床意義的曲霉菌種，包括煙曲霉和土曲霉。本發明的試劑盒還可以進一步檢測煙曲霉中的兩種多唑抗性機制。當與其他臨床和實驗室檢查結合使用時，本發明的試劑盒檢測結果有助于血液學和重癥監護病房患者的侵襲性肺曲霉菌病的診斷。

技術領域

本發明涉及曲霉菌檢測領域，具體地涉及基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒及其使用方法。

背景技術

曲霉菌廣泛分布于環境中。據不完全統計人體每天吸入的曲霉孢子可達數百個之多。對于免疫缺陷體，例如器官移植患者、癌癥患者及艾滋病而言，沒有及時清除吸入的孢子，易導致侵襲性肺曲霉病(IPA)。95％以上的IPA是由煙曲霉感染導致的，其次為土曲霉。IPA以肺部感染為主，病死率超過70％。其臨床表現與他原因肺炎、結核相似，無特異性，病情重、治療方案不統一，極易誤診漏診。因此早期診斷是改善曲霉菌感染患者的預后、降低病死率的關鍵。

根據2016年美國感染病學會(IDSA)公布的曲霉病治療指南，伏立康唑被推薦為治療侵襲性曲霉病的首選藥物，其他抗真菌如兩素B和卡泊芬凈等作為后備藥物使用。但是由于全球范圍內含唑類農藥的大規模應用，以及臨床上唑類抗真菌藥物的長療程使用，煙曲霉對伏立康等劑耐性呈逐年上升趨勢。據文獻顯示，臨床菌株耐藥率在美國約為3.6％，中國為4％，日本為11％。

目前臨床上的IPA檢測方法包括直接鏡、培養和血清免疫學，但存在主觀性強、培養時間長且敏感不高、血清學法靈度低的缺點。目前雖然針對曲霉開發了許多基于PCR快速檢測的方法，但這些方法主要針對食源、藥源的曲霉。專門針對引發臨床疾病的曲霉檢測方法已知有例如CN109055502A公開的基于真菌游離DNA的侵襲性真菌感染快速多重PCR鑒定診斷檢測方法。該方法可鑒定由臨床常見和高發的白色念珠菌、熱帶假絲酵母、近平滑假絲酵母、克柔念珠菌、光滑念珠菌及煙曲霉造成的侵襲性感染。再例如，CN105018575A公開的多重PCR在敗血癥真菌檢測中的應用。其設計了一種多重PCR體系，能夠彌補已有真菌檢測方法的不足，為發病急、死亡率高的真菌性敗血癥及膿毒癥臨床治療提供明確的用藥信息，從而贏得寶貴的治療時間。

綜上所述，目前還沒有專門用于同時檢測煙曲霉、土曲霉和曲霉耐藥的檢測方法。

發明內容

針對現有技術中的至少部分技術問題，本發明提供能夠快速檢測IPA致病曲霉菌并分型的試劑盒及其使用方法。優選地，本發明進一步提供能夠對IPA致病菌耐藥性進行檢測的試劑盒。具體地，本發明包括以下內容。

本發明的第一方面，提供一種基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其包含能夠以混合物形式存在的通用引物和特異性探針組，其中，所述通用引物能夠結合至曲霉屬真菌的基因保守區，從而能夠在實時熒光PCR中擴增源自曲霉屬真菌的保守片段，所述特異性探針組包括能夠與所述保守片段的部分序列互補結合的第一探針、第二探針和第三探針，所述第一探針能夠與源自煙曲霉的序列特異性互補結合，所述第二探針能夠與源自土曲霉的序列特異性互補結合，所述第三探針能夠與源自曲霉屬真菌的保守序列特異性互補結合。

在某些實施方案中，根據本發明所述的基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其中，第一探針包含對應于第一通道的熒光染料，第二探針包含對應于第二通道的熒光染料和第三探針包含對應于第三通道的熒光染料。

在某些實施方案中，根據本發明所述的基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其中，所述混合物溶解于緩沖液中，且所述緩沖液包含190-210mM Tris-HCl、190-210mM KCl、90-110mM(NH₄)₂SO₄、5-10mM MgSO₄，且pH值為8.0-8.5。

在某些實施方案中，根據本發明所述的基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒進一步包含內部質控和陽性質控。