[發(fā)明專利]基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒及其使用方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011232177.6
• 申請日: 2020-11-06
• 公開（公告）號: CN112176096A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱麗媛;楊曉明;夏小凱;黃迎燕;程天齡;吉斯·丁格曼斯
• 申請（專利權(quán)）人: 上海捷諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京北匯律師事務(wù)所 11711
• 代理人: 高元吉

1.一種基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其特征在于，包含能夠以混合物形式存在的通用引物和特異性探針組，其中，所述通用引物能夠結(jié)合至曲霉屬真菌的基因保守區(qū)，從而能夠在實時熒光PCR中擴增源自曲霉屬真菌的保守片段，所述特異性探針組包括能夠與所述保守片段的部分序列互補結(jié)合的第一探針、第二探針和第三探針，所述第一探針能夠與源自煙曲霉的序列特異性互補結(jié)合，所述第二探針能夠與源自土曲霉的序列特異性互補結(jié)合，所述第三探針能夠與源自曲霉屬真菌的保守序列特異性互補結(jié)合。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其特征在于，第一探針包含對應于第一通道的熒光染料，第二探針包含對應于第二通道的熒光染料和第三探針包含對應于第三通道的熒光染料。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其特征在于，所述混合物溶解于緩沖液中，且所述緩沖液包含190-210mM Tris-HCl、190-210mM KCl、90-110mM(NH₄)₂SO₄、5-10mM MgSO₄，且pH值為8.0-8.5。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其特征在于，進一步包含內(nèi)部質(zhì)控和陽性質(zhì)控。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其特征在于，所述通用引物的序列如SEQ ID NO：1和2所示，所述第一探針的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二探針的序列如SEQ ID NO：4所示，所述第三探針的序列如SEQ ID NO：5所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其特征在于，進一步包含針對煙曲霉耐藥位點的引物和探針，且針對煙曲霉耐藥位點的正向引物與反向引物的摩爾比為1:(8-10)，針對煙曲霉耐藥位點的探針設(shè)計為與野生型探針的Tm差值為2。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其特征在于，所述煙曲霉耐藥位點選自TR34、L98H、Y121F和T289A組成的組中的至少一種。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重PCR對曲霉菌分型的試劑盒，其特征在于，進一步包括熱啟聚合酶。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括使用所述通用引物和所述特異性探針組構(gòu)建反應體系的步驟，和對所述反應體系進行PCR擴增的步驟。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述PCR擴增包括：

(1)預變性步驟，條件為2分鐘、95℃；

(2)循環(huán)反應步驟，條件為15秒、94℃變性，60秒、58℃退火、延伸，共30-50個循環(huán)；

(3)熔解步驟：45℃、90秒，然后由45℃梯度升溫至85℃。