[發明專利]一種同時檢測水華藍藻拉氏尖頭藻和產擬柱胞藻毒素特異基因的試劑盒及其方法

有效

• 申請號: 202011232085.8
• 申請日: 2020-11-06
• 公開（公告）號: CN112342279B
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發明（設計）人: 楊軍;譚鳳嬌;肖鵬
• 申請（專利權）人: 中國科學院城市環境研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 秦華

本發明建立了一種同時檢測水華藍藻拉氏尖頭藻和產擬柱胞藻毒素特異基因的試劑盒及其方法。所述試劑盒含有SEQ ID No:1?4所示序列；其中SEQ ID No:1?2為檢測拉氏尖頭藻特異基因rpoC1的上下游引物，SEQ ID No:3?4為檢測產擬柱胞藻毒素特異基因cyrJ的上下游引物。還含有rpoC1基因熒光標記TaqMan探針和cyrJ基因熒光標記TaqMan探針。應用所述試劑盒進行數字PCR檢測的方法靈敏度高、準確性高、特異性高，能方便精準地對水環境樣本中拉氏尖頭藻豐度和產擬柱胞藻毒素潛力進行測定和評估，實現拉氏尖頭藻低豐度時期成功檢出，達到早期檢測和早期預警的效果。

技術領域

本發明涉及分子生物檢測領域，尤其涉及一種同時檢測水華藍藻拉氏尖頭藻和產擬柱胞藻毒素特異基因的試劑盒及其方法。

背景技術

由于氣候變暖、水體富營養化等原因，導致內陸水體藍藻水華發生頻率和強度增加，特別是湖庫型飲用水源地容易發生藍藻水華、甚至產生藻類毒素，不僅增加水處理成本、而且對人類健康造成巨大威脅。內陸水體中水華藍藻種類很多，其中拉氏尖頭藻(Raphidiopsis raciborskii)，之前稱為拉氏擬柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii)，是近年來在我國東南地區發現的一種新型的水華藍藻，由于其具有較強的入侵性和高度適應性，其全球分布從最初的熱帶地區逐漸擴散到亞熱帶和溫帶地區。近幾十年來，在溫帶和亞熱帶地區拉氏尖頭藻水華事件的發生頻率逐漸增加，其水華發生規律顯著不同于微囊藻。值得注意的是，全球范圍來看澳大利亞、東南亞地區的拉氏尖頭藻存在產毒株系，其毒素是由產毒基因表達產生的擬柱胞藻毒素(cylindrospermopsins，CYNs)。擬柱胞藻毒素為肝毒素生物堿，具有水溶性和高穩定性，半衰期較長。在攝入到體內之后，通過不可逆抑制磷酸蛋白酶導致細胞死亡，進而對肝臟造成損害。除此之外，擬柱胞藻毒素還可以促進腫瘤發生、誘發染色體變異和胎兒畸變等。近十多年來，在我國東南地區許多水庫型水源地發現拉氏尖頭藻水華現象，水華形成之前的早期檢測與早期診斷對藍藻水華防控十分關鍵。然而，經典的顯微鏡方法費時費力、而且難于區分產毒株系和非產毒株系，普通的熒光定量PCR方法難于對低豐度藍藻進行有效監測。因此，亟需研發快速、靈敏、準確和高效的技術方法對水體中拉氏尖頭藻豐度及其產毒潛力進行監測和評估。

發明內容

本發明的目的是提供一種使用數字PCR(dPCR)方法同時檢測水華藍藻拉氏尖頭藻與產擬柱胞藻毒素特異基因的方法，應用dPCR方法的靈敏度高、準確性高的優勢，利用特異性引物精確地對拉氏尖頭藻豐度及其產毒能力進行測定和評估，實現拉氏尖頭藻低豐度時期成功檢出，以達到早期檢測和早期預警的效果。

為了實現上述目的，本發明提供一種同時檢測水華藍藻拉氏尖頭藻和產擬柱胞藻毒素特異基因的試劑盒，其特征在于，含有SEQ ID No:1-4所示序列；其中SEQ ID No:1-2為檢測拉氏尖頭藻特異基因rpoC1的上下游引物，SEQ ID No:3-4為檢測產擬柱胞藻毒素特異基因cyrJ的上下游引物。

進一步，還含有rpoC1基因熒光標記TaqMan探針(VIC)和cyrJ基因熒光標記TaqMan探針(FAM)，其中rpoC1基因熒光標記TaqMan探針的序列為SEQ ID No:5，cyrJ基因熒光標記TaqMan探針的序列為SEQ ID No:6。

本發明還提供一種同時檢測水華藍藻拉氏尖頭藻和產擬柱胞藻毒素特異基因的檢測方法，其特征在于，使用了所述試劑盒。

進一步，步驟為，將待測樣本的DNA于暗光條件下加入到反應體系中，進行雙模塊dPCR擴增，讀取數據結果，根據數據結果的平均值分別計算拉氏尖頭藻特異基因rpoC1和產擬柱胞藻毒素特異基因cyrJ的拷貝數。

進一步，待測樣本的DNA濃度為每個反應1-10⁴個拷貝。