[發(fā)明專利]一種與肝臟損傷相關(guān)的ERO1α啟動子區(qū)甲基化分子標(biāo)志物的篩選方法及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011226556.4
• 申請日: 2020-11-05
• 公開（公告）號: CN112501276A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜怡鄧;張慧萍;徐龍;張輝;焦運;吳欣妍;馬芳;劉圓
• 申請（專利權(quán)）人: 寧夏醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6809
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 程華

本發(fā)明公開了一種與肝臟損傷相關(guān)的ERO1α啟動子區(qū)甲基化分子標(biāo)志物的篩選方法及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，以CBS^+/?基因敲除小鼠和肝細(xì)胞為研究對象，提取組織或細(xì)胞的RNA和蛋白，篩選出與HHcy誘導(dǎo)肝損傷ERO1α啟動子區(qū)高甲基化位點，在細(xì)胞水平驗證ERO1α啟動子區(qū)高甲基化的調(diào)控機制，建立了由ERO1α和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶網(wǎng)絡(luò)組成的Hcy誘導(dǎo)肝損傷特異性疾病聯(lián)合診斷方法。該方法簡單可靠，取材方便，靈敏度和特異性均與生化診斷的結(jié)果高度吻合，在HHcy誘導(dǎo)肝臟損傷性疾病的早期診斷與預(yù)后評估中具有極大的應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種與肝臟損傷相關(guān)的ERO1α啟動子區(qū)甲基化分子標(biāo)志物的篩選方法及其應(yīng)用，具體地說，涉及一種與肝臟損傷，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(G9a)及ERO1α啟動子區(qū)甲基化分子標(biāo)志物的篩選方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化酶1(ERO1α)，一種ER定位的蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶(PDI)氧化酶，從還原的PDI 中接收電子并將其傳遞給分子氧，催化氧介導(dǎo)的二硫鍵形成，ERO1α氧化PDI從分子氧形成過氧化氫生成氧化應(yīng)激，因此ERO1α在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。

DNA甲基化為DNA修飾的重要形式，是指不改變DNA序列的前提下，改變基因的遺傳表現(xiàn)，主要通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶實現(xiàn)的，真核生物DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶主要有3類:DNMTl、DNMT2、DNMT3。DNA甲基化主要發(fā)生在啟動子區(qū)富含CpG島位置，通常DNA容易在 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的的調(diào)控下發(fā)生高甲基化狀態(tài)，因此在疾病的發(fā)生過程中精準(zhǔn)的對啟動區(qū)發(fā)生甲基化位點的檢測變的至關(guān)重要。

染色質(zhì)重塑在調(diào)節(jié)特定基因的表達中起重要作用，組蛋白賴氨酸的甲基化會造成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達的改變，主要是由于特異的組蛋白甲基化酶作用的。H3K4甲基化與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松以及基因表達相關(guān)，伴隨啟動子低甲基化。而H3K9甲基化與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密以及基因表達抑制有關(guān)，伴隨啟動子高甲基化。研究表明，H3K9二甲基化(H3K9me2)參與沉默基因的啟動子區(qū)域，可以抑制基因表達，但是組蛋白甲基化是否調(diào)控ERO1α在細(xì)胞凋亡過程中的作用是未知的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種與肝臟損傷相關(guān)的ERO1α啟動子區(qū)甲基化分子標(biāo)志物的篩選方法及其應(yīng)用，該方法開發(fā)一種針對早期防治肝臟損傷的治療靶標(biāo)以及檢測肝臟損傷更為敏感的指標(biāo)，該發(fā)明中組織標(biāo)本來自于雄性CBS^+/-基因敲除小鼠，細(xì)胞是人源的肝細(xì)胞，主要的檢測指標(biāo)主要使用MassArray甲基化分析檢測ERO1α啟動子區(qū)甲基化位點，使用CHIP 檢測H3K9和DNMT1與ERO1α的結(jié)合，使用qRT-PCR和western blot檢測過表達或干擾DNMT1和G9a的表達檢測ERO1α的改變，以及使用MassArray甲基化分析檢測ERO1α啟動子區(qū)甲基化的改變。

其技術(shù)方案如下：

一種與肝臟損傷相關(guān)的ERO1α啟動子區(qū)甲基化分子標(biāo)志物的篩選方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建CBS^+/-基因敲除小鼠高同型半胱氨酸血癥模型，Hcy干預(yù)肝細(xì)胞體外模擬高同型半胱氨酸血癥。

(2)使用nMS-PCR檢測CBS^+/-高同型半胱氨酸血癥小鼠肝臟中ERO1α甲基化狀態(tài)，以及使用MassArray甲基化分析檢測Hcy干預(yù)肝細(xì)胞后ERO1α的啟動子區(qū)的甲基化位點。

(3)熒光素酶檢測ERO1α的啟動子區(qū)活性位置。

(4)使用qRT-PCR和western blot檢測DNMTs的表達以及對ERO1α的調(diào)控。

(5)干擾或過表達DNMT1后檢測ERO1α的表達以及MassArray甲基化分析檢測ERO1α啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。