[發(fā)明專利]利用聚羥基丁酸作為胞內(nèi)碳庫提高子囊霉素產(chǎn)量的方法

有效

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• 申請日: 2020-11-05
• 公開（公告）號: CN112301072B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 聞建平;王盼;銀瑩
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76;C12R1/55;C12P17/18
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王麗

本發(fā)明提出利用聚羥基丁酸作為胞內(nèi)碳庫提高子囊霉素產(chǎn)量的方法。利用基因工程技術(shù)將來自羅爾斯通氏菌的聚羥基丁酸合成基因phaC和來自吸水鏈霉菌子囊亞種的聚羥基丁酸分解基因fkbU串聯(lián)整合到出發(fā)菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus ATCC14891基因組上，通過發(fā)揮聚羥基丁酸對碳源的儲存和降解再利用的功效來促進(jìn)子囊霉素的持續(xù)生產(chǎn)，使得基因工程菌株中子囊霉素發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到至626.30mg/L，較出發(fā)菌株ATCC14891提高了211％。本發(fā)明提出的方法為子囊霉素的高產(chǎn)提供了一種新的策略，該方法在FK520的工業(yè)化生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于鏈霉菌基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過將聚羥丁酸合成基因phaC和分解基因fkbU串聯(lián)整合到吸水鏈霉菌子囊亞種的基因組上，提出一種利用聚羥基丁酸作為胞內(nèi)碳庫提高子囊霉素產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)

子囊霉素(Ascomycin,簡稱FK520)是一種由吸水鏈霉菌子囊亞種(Streptomyceshygroscopicus var.ascomyceticus)發(fā)酵生產(chǎn)的天然大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。由于其特殊的物理結(jié)構(gòu)，F(xiàn)K520具有多種生理和藥理活性，如抗真菌、抗瘧疾、免疫抑制作用及抗驚厥作用。因此，F(xiàn)K520在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。然而，作為一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的次級代謝產(chǎn)物，F(xiàn)K520目前的發(fā)酵產(chǎn)量仍處于較低水平，這嚴(yán)重限制了其工業(yè)化的進(jìn)程，因此開發(fā)能夠提高FK520產(chǎn)量的方法迫在眉睫。

近年來，科研工作者在提高FK520產(chǎn)量方面做了大量工作，包括野生菌株的隨機(jī)誘變、代謝途徑的改造、調(diào)控因子的機(jī)制研究等。例如Wang等人采用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)篩選出FK520高產(chǎn)吸水鏈霉菌工程菌株，F(xiàn)K520產(chǎn)量可達(dá)546mg/L(CN107245460-A)。Tang等人通過將乙基丙二酰輔酶A的生物合成基因整合至吸水鏈霉菌基因組中，使得FK520產(chǎn)量可達(dá)550mg/L(CN107629994-A)。Wen等人通過將途徑特異性調(diào)控基因fkbN及核糖體再生基因frr在吸水鏈霉菌中過表達(dá)，使FK520產(chǎn)量達(dá)到500mg/L(CN104762247-A)。然而作為鏈霉菌生產(chǎn)的次級代謝產(chǎn)物，F(xiàn)K520在發(fā)酵后期的合成常常因?yàn)樘荚垂?yīng)量的不足而受到限制，因此保證發(fā)酵后期碳源合理且充足地供應(yīng)是一個亟待解決的問題。簡單地在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加過量的碳源會抑制菌株的生長，降低次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此，開發(fā)和利用胞內(nèi)碳源供應(yīng)站對抗生素的合成具有重要意義。

聚羥基丁酸鹽(Polyhydroxybutyrate,簡稱PHB)是許多微生物中普遍積累的一種多功能天然聚合物。由于其生物相容性、熱塑性和生物降解性，PHB在體外被認(rèn)為是傳統(tǒng)石化塑料的綠色替代品。例如Nian等人以PHB及其結(jié)構(gòu)類似物為原料生產(chǎn)出高隔離且可全生物降解的BOPLA薄膜，能夠有效消除塑料污染(CN111703166-A)。此外對微生物來說，當(dāng)環(huán)境中碳源過剩時，PHB作為胞內(nèi)碳源存儲顆粒積累，在環(huán)境中沒有合適的碳源時分解為單體供細(xì)胞利用。在之前的研究中，PHB已經(jīng)被證明可以提高一些初級代謝物的產(chǎn)量。例如，Ji等人通過基因工程手段實(shí)現(xiàn)1,3-丙二醇和PHB的聯(lián)產(chǎn)，使得1,3-丙二醇的產(chǎn)量達(dá)到76.21g/L(CN111500514-A)。然而，迄今為止，PHB對抗生素生產(chǎn)的影響還沒有被報道。

在吸水鏈霉菌子囊亞種中，F(xiàn)K520由12個前體分子組裝合成。其中，一半的前體(5個甲基丙二酰-CoA分子和1個乙基丙二酰-CoA分子)可由乙基丙二酰-CoA途徑(EMC)合成。在細(xì)菌中，EMC途徑主要負(fù)責(zé)C2-二元羧酸向C4或C5單元的同化。在一些鏈霉菌中，EMC途徑的同化產(chǎn)物可以為抗生素的生物合成提供輔酶A類前體。值得注意的是，EMC途徑合成的乙基丙二酰-CoA是FK520的特異性前體，用于構(gòu)成FK520的特殊結(jié)構(gòu)。因此，維持EMC途徑的碳通量對FK520的合成至關(guān)重要。EMC途徑中前體的合成主要取決于3-羥基丁酰CoA的供應(yīng)，它不僅可以由初級代謝物乙酰乙酰CoA合成，也可以通過PHB的分解得到。因此，開發(fā)PHB作為FK520合成的胞內(nèi)碳源供給站意義重大。